介绍

胰凝乳蛋白酶是属于水解酶的一种酶，它通过在肽键之间掺入水来打破共价键。它的活性位点具有丝氨酸残基，这就是将其归类为丝氨酸内切蛋白酶的原因（Di Cera，2009；Navarrete del Toro & García Carreño，2019）。该酶催化与芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的羧基相邻的肽键的水解(( Zwilling & Neurath, 1981 ; Zhou et al., 2011 )，尽管它也可以水解位于芳香族氨基酸一侧的肽键。其他大的疏水残基，例如蛋氨酸和亮氨酸（Zwilling & Neurath, 1981；Zhou et al., 2011；Navarrete del Toro 和 García Carreño，2019），以减小多肽链的大小并允许外切蛋白酶发挥作用（ McDonald，1985； Barrett，1994）。

对这种生物催化剂的研究主要集中在鱼类上，主要是寻找从渔业产生的废料中获取酶的替代方案（Zhou et al., 2011）。然而，与鱼类和陆地生物中报道的研究相比，甲壳类动物的研究有限（Balti 等人，2012 年；Navarrete del Toro 和 García-Carreño，2019 年），1980 年迄今为止，只有大约 36 项研究指出了这种酶和其中几乎三分之一是在过去五年中进行的（13 项研究），这可能是因为研究主要针对胰蛋白酶，因为胰蛋白酶可代表高达 60% 的消化蛋白水解活性（Cruz-苏亚雷斯，1996；Muhlia-Almazán 等人，2008）。

对该酶检测的早期研究并不认为它具有相关性（Lee 等人，1984 年；Glass & Stark，1994 年）；然而，随着在甲壳类动物的几项研究中发现胰凝乳蛋白酶的存在，这种想法已经发生了变化

甲壳类动物的酶学表征

在大多数甲壳类动物研究中，胰凝乳蛋白酶并未得到专门评估，而是一系列消化酶研究方案的一部分。同样，大多数特征都是在十足目甲壳类动物中完成的，例如虎虾斑节对虾、马来西亚罗氏沼虾、白虾、南美白对虾、常见的加勒比龙虾、乌鳢、红龙虾中断虾和褐虾californiensis（Tsai 等人，1986；Tsai 等人，1991；Hernández-Cortes 等人，1997；Perera 等人，2008；Bibo-Verdugo 等人，2015；纳瓦雷特德尔托罗等人，2015；八塔，2020 年）；因为它们是被开发的物种可能在水产养殖作物中被开发的物种。

在鉴定甲壳类胰凝乳蛋白酶的酶学表征研究中，对最适温度、热稳定性、最适 pH、pH 稳定性、等电点和离子效应等参数进行了评估，发现活性范围可能因物种而异，在 30 至 30 之间变化。最佳温度为60℃，热稳定性在0℃至75℃之间，最佳pH值在7至10之间，pH稳定性在3至12点之间（表2）。在胰凝乳蛋白酶等电点分析的特殊情况下，研究提到了其亚型的检测（Navarrete del Toro 等人，2015），例如Hernández-Cortes 等人。( 1997 )在南美白对虾中发现了一个等电点，纳瓦雷特·德尔·托罗等人。(2015)在P. californiensis 中，它确定了单一形式的胰凝乳蛋白酶的存在；同时，蔡等人。(1991 )报道斑节对虾中存在两个等电点，其值为3.0和3.2，表明有两种亚型。在大多数研究的物种中，已经发现了该酶的两种亚型（ Navarrete del Toro 等人，2011）；但例外，如Panulirirus Interruptus，它有五种亚型

测定技术

用于测定甲壳类动物胰凝乳蛋白酶样活性的技术得到不同工具的支持。可以通过使用特定的合成底物来实现，其中Hummel (1959)、Erlanger & Edel (1964)和Del Mar 等人描述的技术。（1979）被使用；另一方面，可以使用酶抑制剂，例如Tsai 等人使用的那些。(1986)，Vega-Villasante 等人。(1995)和纳瓦雷特·德尔·托罗等人。（2015）。

确定生物体中是否存在胰凝乳蛋白酶的最简单方法可能是使用该酶的特定底物，例如Hummel (1959)研究中提出的拉苯甲酰酪氨酸乙酯 (BTEE) ；或2-硝基-4羧基苯基-N，N-二苯基氨基甲酸酯(NCDC)，由Erlanger & Edel (1964)提及；或琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-P-硝基苯胺（SAAPNA或SAAPFNA），这是由Del Mar等人提出的。（1979）。上述技术的工作原理是检测底物和酶之间相互作用的变化，从而促进染料分子的释放，可以通过分光光度法中的比色法读取（Hummel，1959；Erlanger & Edel，1964；德尔马等人，1979）。

据Erlanger & Edel (1964)方法报道，南美白对虾和白对虾未检测到胰凝乳蛋白酶样活性( Lee et al., 1984 )；而当使用 BTEE ( Hummel, 1959 ) 作为底物时，已报道了矛盾的结果，因为在H. gammarus 等物种中没有发现胰凝乳蛋白酶活性 ( Glass & Stark, 1994 )，但在P. bennetae、P. plebejus、M中.检测到ausstreliense和S. serrata活性Bonorino & Anderson, 2009 )。SAAPNA 用作底物（Del Mar 等人，1979）是迄今为止使用最广泛的检测方法之一，因为它是对胰凝乳蛋白酶活性非常敏感的底物（Tsai 等人，1986），在所有使用它的研究中都显示出其活性，例如进行的调查南美白对虾（Le Moullac et al., 1996；Hernández-Cortes et al., 1997）、P. muelleri（FernándezGimenez et al., 2001）、D. magna（Von Elert et al., 2004）、P. . Interruptus ( Celis-Guerrero et al., 2004 )、P. subtilis ( Souza et al., 2009 ) 和P. californiensis (纳瓦雷特德尔托罗等人，2015；托雷斯-奥乔亚，2020）。

正如需要观察胰凝乳蛋白酶的活性一样，也研究了它的抑制作用，这是在其通过特定底物表征或存在的同时进行的，目的是使酶水解的完全或部分抑制变得明显。这些物质的存在（García-Carreño，1992）。最广泛使用的胰凝乳蛋白酶抑制剂是糜蛋白酶（Tsai et al., 1986）；甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲基酮 (TPCK) ( Tsai et al., 1986 ; Hernández Cortes et al., 1997 ; Omondi, 2005 ; Navarrete del Toro et al., 2015 ; Manriquez-Santos et al., 2018）；苯甲氧基-苯丙氨酸氯甲基酮(ZPCK)( Lemos等人，2000 )；苯甲基磺酰氟（PMSF）（Tsai 等人，1986；Hernández-Cortes 等人，1997；Omondi，2005；Bibo-Verdugo 等人，2015；Manriquez-Santos 等人，2018）；大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（Tsai 等人，1986；Manriquez-Santos 等人，2018）；和ZL-丙氨甘氨酰-L-苯丙氨酸-氯酮(ZAGPCK)( Tsai等人，1986；Chen等人，1991 )。

了解活性阈值的结构、功能、理化特征、反应底物以及抑制作用，可以帮助我们充分表征这种酶，这使我们能够考虑为感兴趣的物种配制功能性食品，以及可能的资源这些生物体提供食物，甚至其在生物技术过程中作为生物分子的潜力，用于处理和使用不同的底物。因此，从基础生理知识到工业应用，了解这种酶将有助于其研究的进展，并指明研究和应用的途径。

胰凝乳蛋白酶的功能和作用

尽管自 20 世纪 80 年代起，Galgani 等人的研究就记录了胰凝乳蛋白酶型酶的活性。(1984)，它一直被认为是甲壳类动物中催化活性较低的酶( García-Carreño et al., 1994 ; Cruz-Suarez, 1996 ); 正如Lee 等人的研究那样，它在这些生物体中的存在甚至受到质疑。(1984) ，其中他们明确指出，斑节对虾幼体中不存在胰凝乳蛋白酶型酶活性，这与其他甲壳类物种如H. americanus ( Brockerhoff et al., 1970 )、Lithodesa esquispinus和Paralithodescam tschaticus中报道的情况类似。（Galgani & Nagayama，1987），得出了相同的结论。可能是因为在第一次研究中没有检测到这种酶的活性，因此对其相关研究的兴趣下降了（García-Carreño 等人，1994 年；Von Elert 等人，2004 年；Omondi，2005 年），这与胰蛋白酶相比，导致该酶的信息体延迟（Muhlia-Almazán 等，2008）。由于上述原因，关于化学胰蛋白酶在甲壳类动物消化过程中的作用机制存在信息差距（Bibo-Verdugo 等人，2015；Navarrete del Toro 和 García Carreño，2019）。

当比较胰凝乳蛋白酶与胰蛋白酶的可用信息时，这种信息的缺乏变得更加明显；它是甲壳类动物中研究最多的消化酶，被认为负责这些生物体中约 60% 的消化蛋白水解活性（Vega Villasante 等人，1995；Albuquerque-Cavalcanti 等人，2001；Carrillo-Farnés 等人） ., 2007 ; Muhlia-Almazan 等人, 2008 )。胰蛋白酶的重要性主要是因为它是第一个在甲壳类动物中检测和表征的蛋白酶（Muhlia-Almazán 等人，2008；Sainz-Hernandez 和 Cordova-Murueta，2009）。对于其检测，技术厄兰格等人。(1961 )，其使用苯甲酰基-DL-精氨酸4-硝基苯胺氯化物(BAPNA)；和Hummel (1959 )，其中使用甲苯磺酰精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)，是常用的。这两种方法都是为检测其他生物体中的胰蛋白酶而开发的；然而，它们已被批准用于检测甲壳类动物中的化学胰蛋白酶（ Brockerhoff 等人，1970； Sainz 等人，2004； Von Elert 等人，2004； Omondi，2005； Navarrete del Toro 等人，2011） 。

直到其他底物（例如 SAAPNA）的开发，才有可能检测糜蛋白酶水解活性的存在（García Carreño 等，1994）。尽管如此，对甲壳类动物中这种酶的研究仍然集中在胰蛋白酶的检测和分析上，而忽略了胰凝乳蛋白酶的分析，胰凝乳蛋白酶被认为是一种低活性的补充酶（Muhlia Almazán et al., 2008；Sainz-Hernández & Córdova） -穆鲁埃塔，2009）。

Tsai 等人揭示了该酶不水解 BTEE 底物的可能原因。(1986)，其中提到虽然 BTEE 提供了胰凝乳蛋白酶作用的氨基酸，但它缺乏以次级方式与酶相互作用的其他氨基酸，因此它可以发挥其功能，Van Wormhoudt也提到了这一点等人。(1992)，他们报道甲壳类胰凝乳蛋白酶对天然底物的反应性比对合成底物的反应性更强，这是由于单独的多肽链的长度所致。

这导致人们认为胰蛋白酶是蛋白质水解比例最高的蛋白酶（Carrillo-Farnés 等人，2007 年；Muhlia-Almazán 等人，2008 年）。但随后的研究认为水解能力最高的酶是胰凝乳蛋白酶( Tsai et al., 1986 ; Buarque et al., 2010 ; Navarrete del Toro et al., 2011 ; Gora et al., 2018 )，而这种酶并没有得到更大的重视。由于这个原因，观察到了信息差距，并且围绕这种酶的活性出现了新的问题，因为信息的缺乏迫使研究人员使用其他生物体的酶活性模型。Navarrete del Toro 和 GarcíaCarreño，2019），从而建立了一个产生新的基础知识的机会领域，这些知识影响了作为人类食物来源的重要生物体的消化生理学研究。

胰凝乳蛋白酶研究的新方面之一是其在胶原蛋白溶解活性中的功能（Navarrete del Toro 等人，2015），这涉及从分类到应用的审查，目前通过更精确的设备、生成的知识和技术的调整使其变得可行以达到具体的结果。

胰凝乳蛋白酶的胶原蛋白溶解功能使其与 Brachyurin 酶相似（Hernández-Cortes 等人，1997 年；Navarrete del Toro 等人，2015 年）；在这个意义上，Rudenskaya (2003 ) 提出了一种将胰凝乳蛋白酶和短泌尿素分离成两个不同酶组的方法，因为在分析整合短泌尿素的氨基酸链结构时，观察到胰凝乳蛋白酶在以下方面存在差异：多肽链，主要是负责将酶锚定到待水解的多肽链上的氨基酸。与此相反，纳瓦雷特·德尔·托罗和加西亚·卡雷尼奥 (2019)指出 Brachyurin 的分类是不正确的，不应被视为一组与胰凝乳蛋白酶不同的酶，因为在甲壳类动物中，胰凝乳蛋白酶的胶原溶解活性是普遍存在的。由于这些不同的立场以及在这方面缺乏更准确的信息，建议将这些基团称为具有胰凝乳蛋白酶样活性的消化酶（Navarrete del Toro＆García-Carreño，2019）。

甲壳类动物中的胰凝乳蛋白酶

尽管在经济上重要的甲壳类物种中对胰凝乳蛋白酶的研究很少，但在鱼类等其他水生生物群体中却重复了这一情况（Lauff＆Hofer，1984；Rungruangsk-Torrissen等人，2006；Castillo-Yañez等人，2009；哈吉·阿里等人，2010）。在这一组中，胰凝乳蛋白酶由单条多肽链组成（Lauff & Hofer，1984；Zhou 等，2011），与甲壳类动物一样（Hernández-Cortes 等，1997；Navarrete del Toro 等，2015 ）），研究主要集中在使用来自反刍动物的酶的标准来比较该组生物之间的胰凝乳蛋白酶活性（Tsukada＆Blow，1985）。根据这些研究，观察到胰凝乳蛋白酶比哺乳动物的胰凝乳蛋白酶具有更高的水解活性（Lauff & Hofer，1984；Celis，2003；Rungruangsk-Torrissen 等，2006； Zhou 等，2011 ；Rungruangsk-Torrissen 等，2006 ）。纳瓦雷特德尔托罗等人，2015）

如上所述，在商业上重要的甲壳类动物中，自2000年以来，对胰凝乳蛋白酶的研究主要集中在 P. chinensis ( Shi et al., 2008 )、P. subtilis ( Buarque et al., 2010 )、南美白对虾 ( Navarrete del Toro et al., 2011 ) 以及在培养条件下具有开发潜力的物种中的这种酶也进行了研究，例如印度对虾( Omondi, 2005 )、 南美白对虾 (Omondi, 2005)、 . californiensis ( Navarrete del Toro et al., 2015 ; Torres-Ochoa, 2020 ) 和M. tenellum（Espinosa-Chaurand 等人，2017）；这是因为了解生物体的酶动力学和消化生理学信息非常重要（Gamboa-Delgado 等人，2003 年；Simon，2009 年），以影响和利用其在平衡饲料配方中的生理潜力（Carrillo-Farnés 等人）等人，2007 年；西蒙，2009 年；Buarque 等人，2010 年），从而提高经济作物的产量。甲壳类动物的这种消化生理潜力通过蛋白质消化过程中胰凝乳蛋白酶活性的结果得到证明，因为通过其活性，较小的多肽被释放，其他酶作用于这些多肽以获得存在的不同氨基酸（Tsai等人，1991；Navarrete del Toro &加西亚-卡雷诺，2019）。

已经对野生生物和培养系统中的生物之间的胰凝乳蛋白酶活性进行了分析，例如Da Silva 等人进行的分析。(2014)在M. amazonicum中，他们报告说，胰凝乳蛋白酶以及一般蛋白酶的酶活性在培养生物中较高；与此相反，P. californiensis , Torres-Ochoa (2020)观察到这种酶的活性在培养生物中比在野生生物中低。这些差异可能是由于两种特殊情况造成的，即食物或基质的类型以及食用时间或喂食之间的时间（偶发性饥饿）。有人提到，从更具体的底物（例如 SAAPNA）中可以更好地观察到胰凝乳蛋白酶的活性，并且根据所评估的成分或饮食的类型，观察到不同程度的胰凝乳蛋白酶活性，这在培养生物中受到监督和保证，促进了动力学和消化的稳定性。这些生物体的循环，与野生生物体可能发生的情况相反，野生生物体消耗任何其可用的东西，当它有可用的并且通常只有一种或两种不同的成分时，

在饥饿情况下，野生生物体可能存在较高的酶原储备，这些酶原只能在底物存在的情况下被激活，因此它们可以为这些底物的加工做好准备，而饲喂生物体则呈现较低的值，如它们不断地使用酶进行消化过程（Gora 等人，2018 年；Torres-Ochoa，2020 年）。戈拉等人。(2018)与P进行了一项研究。 白鹤，他们评估了饥饿和节食方案下酶活性的差异，报告说喂食的生物体的酶活性低于饥饿的生物体。这是可能的，因为野生生物可能会因为没有食物而经历饥饿期，当它们找到食物时，它们必须迅速摄入以避免与其他动物竞争。因此，它们必须有大量的酶原储备，这些酶原被激活后能够快速水解食物，以充分利用可用的营养物质。

结论

到目前为止，甲壳类动物中的胰凝乳蛋白酶被认为是在这些物种的消化酶动力学中没有活性或活性较低的酶。然而，其研究对于了解氨基酸（尤其是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）的生物利用度至关重要。以及了解涉及这些物种必需氨基酸（例如蛋氨酸和亮氨酸）存在的大残基的水解机制。由于酶活性评估技术的进步以及 SAAPNA 等合成底物的使用，一方面可以检测甲壳类动物中是否存在这种酶，另一方面可以了解更多详细介绍这些物种的消化生理学。