介绍
CRISPR-Cas9 等基因修饰技术的最新进展重新引起人们对猪作为异种移植来源的关注1,2。然而，仍然存在一些问题，例如接受者需要过度的免疫抑制，以及可能在受试者中引入传染病，正如在用最新技术培育的转基因猪进行心脏移植的致命案例中所观察到的那样3。同时，人们相信胎猪器官在发育过程中的免疫学优势可能会减少移植到人体后免疫抑制剂的剂量。在异种移植治疗的早期阶段，Groth 等人。成功通过异种移植将猪胰岛移植到人体，揭示猪胰腺内分泌组织可以在人体内存活4。

我们还考虑利用胎猪捐赠者的这种免疫优势5并比较了移植到脂肪组织的胎猪肾和移植血管吻合的新生猪肾在受体猴体内的排斥程度。结果表明，前者可以通过人类临床实践中使用的免疫抑制药物得到充分控制。6。

近年来，源自多能干细胞（PSC）的人类肠道类器官（HIO）的研究取得了显着进展。由于PSC在适当的条件下有可能分化并发育成含有肠道大部分细胞类型的肠道类器官，因此类器官也有望成为肠道移植的细胞来源。但仍然存在问题；类器官不表现出肠道的完整功能，因为当前的方法不能重现与体内器官发生过程中发生的所有胚层分化的每个组织之间的功能协调。

目前的研究旨在比较通过分离的胎儿肠细胞和胎儿节段组织重新聚集产生的球体移植后的体内成熟程度，以评估胎猪作为小肠再生的组织和细胞来源的潜力。我们检查了移植到免疫缺陷小鼠的网膜组织和肾被膜下区域的胎猪肠道组织的成熟情况。此外，我们还研究了移植物的血管生成和肠神经系统的成熟，例如奥尔巴赫神经丛和神经节细胞。

方法
实验动物与伦理
该实验得到了慈惠大学医学院伦理委员会的批准（批准号2022-044）。实验是按照日本科学委员会的《动物实验适当进行指南》（2006 年）进行的7。

将胎猪肠道移植到免疫缺陷小鼠体内
通过剖腹产从妊娠微型猪获得的胚胎第 30 天 (E30) 的胎儿购自 Fuji Micra Inc.（日本静冈），并用作胎儿肠移植物的供体。使用从 CLEA Japan, Inc.（日本东京）购买的 8 周龄雄性 NOD/ShiJic-scid Jcl 小鼠作为受体（球状体移植：N = 2，节段性肠移植：N = 8）。

将 B6 小鼠胎儿肠道移植到成年 B6 小鼠中

胎儿 (E13) 获自 Sankyo Labo Service Corporation, Inc.（日本东京）购买的怀孕 C57BL/6JJmsSlc 小鼠，并用作胎儿肠移植物的供体。七周大的 C57BL/6JJmsSlc 雄性小鼠 (N = 3) 用作同基因移植的受体作为对照。

麻醉和安乐死方法
采购胎猪和B6小鼠小肠作为移植物
怀孕猪在手术前禁食12小时，但允许喝水。肌肉注射 2 mg/kg 赛拉嗪镇静后，吸入 5% 异氟烷诱导麻醉，并维持在 1-3%。E30胎猪经中线10cm切口剖腹产；怀孕猪分娩后缝合切口。胎儿立即被断头处死，并在手术显微镜下获取胎儿肠道。怀孕的 B6 小鼠 (E13) 在用 5% 异氟烷诱导后也维持在 1-3% 异氟烷麻醉下。剖腹产后，对怀孕的小鼠进行放血安乐死。胎儿也立即被断头处死，并在手术显微镜下获取胎儿肠道。

受者手术
用5%异氟醚诱导后，受体小鼠在1-3%异氟醚维持麻醉下接受移植手术，并保温直至恢复。

受体动物的护理和观察
实验动物在12小时明暗循环的环境中随意饮水和食物。通过颈椎脱位对受体小鼠实施安乐死，并在研究结束时获得移植组织。

胎儿肠移植方法
胎儿肠球体形成
将胎儿肠组织收集在含有 Gibco TM最低必需培养基 α (MEMα)（Thermo Scientific, Waltham, MA, United States of America）的 1.5 mL 试管中。将管以 300 × g 离心 5 分钟，除去上清液。然后，1,000 μL Accutase TM(Innovative Cell Technology, San Diego, CA, United States of America) 在室温下分配并通过涡旋混合。将细胞悬液孵育5分钟，移液，再次涡旋，300×g离心5分钟，去除上清液。然后，加入1000μL含有10μM Y2763（Wako，Osaka，Japan）的MEMα培养基和10％胎牛血清（FBS），并通过40μm细胞过滤器（BD Falcon，Oxford，英国）获得单细胞悬浮液。将单细胞悬液调整为 1 × 106细胞计数后含培养基的细胞/mL。将细胞分为 U 型底 96 孔低细胞结合板（Thermo Scientific, Waltham, MA, United States of America），平均 2 × 105细胞/200 μL/孔。最后，将细胞以 1,000 rpm 离心 4 分钟，并在 37°C 下孵育。第二天，将培养基改为不含Y2763的培养基；然后每两天更换一次培养基。第五天收集球体。

将球状和节段性肠组织移植到免疫缺陷小鼠的肾下被膜中
肾囊下移植按照我们之前的报告中所述进行8。简而言之，在全身麻醉下，通过在受体NOD/ShiJic-scid Jcl小鼠中创建中线切口来进行剖腹手术。利用水压在肾下极创建肾下囊空间，移植球状体和约3毫米的分段胎儿小肠。四个星期后，收集标本并进行组织学评估。

胎儿节段小肠大网膜移植
将胎儿小肠切成3毫米的段。在显微镜下将8-0尼龙线穿过内腔。大网膜移植方法是按照我们之前的报告中描述的进行的9。简而言之，在全身麻醉下通过腹部正中切口进行剖腹手术后，将胎儿肠包裹并卷入大网膜中。然后，关闭手术切口。四周和八周后，对小鼠实施安乐死，收集标本并进行组织学评估。

组织学评估
四周和八周后收获移植的移植物并评估结构成熟度和发育。将样品固定在 4% 多聚甲醛（Wako，大阪，日本）中，在 20% 蔗糖中脱水，然后包埋在最佳切割温度 (OCT) 化合物（Sakura Finetek，东京，日本）中。切片厚度为 8-10 μm。使用组织学分析的标准程序进行苏木精和伊红染色以及阿尔新蓝染色。

免疫组织化学染色
将这些切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS：0.01 mol/L，pH 7.2）中洗涤 5 分钟后，通过在 HistoVT One（Nacalai Tesque，京都，日本）中于 70°C 加热 20 小时进行抗原修复。分钟。在 PBS 中清洗后，使用封闭剂 Blocking One Histo (Nacalai Tesque，Kyoto，Japan) 防止非特异性结合 10 分钟，然后将切片与一抗 (1:1,000) 在 4 ℃ 下孵育 24 小时。 °C。使用针对 αSMA（Abcam，剑桥，英国）、CD31（R&D Systems，明尼苏达州，美国）和 E-钙粘蛋白（BD Biosciences，东京，日本）的一抗。用 PBS 清洗 3 次后，将样品与 Alexa Fluor 488、555 和 647 偶联的二抗 1:500 稀释液在室温下孵育 1 小时。将样品在 PBS 中洗涤 3 次，并封固在加有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的封固剂中（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States of America）。此外，还评估了 S-100 蛋白在肠神经系统中的分布。样品用 S-100 一抗（Leica IHC Refine Kit S-100，Leica Biosystems，Wetzlar，德国）染色 15 分钟。接下来，应用兔抗小鼠 IgG（BOND Polymer Refine 检测试剂盒，Leica Biosystems，Wetzlar，德国）10 分钟，然后用抗兔聚合辣根过氧化物酶（BOND Polymer Refine 检测试剂盒，Leica Biosystems，Wetzlar，德国）进行检测）。最后，将切片与 3,3-二氨基联苯胺 (DAB) 一起孵育，并用苏木精复染。

结果
球体形成和移植到肾下被膜
体外培养第一天形成球状体。第 5 天对球体的组织学评估显示，每个球体都覆盖有外膜，并且细胞聚集成球体（无花果。1a-1c）。然而，与未解离和再聚集的胎猪肠道（E30）相比，未证实具有粘膜和间质层的层状结构（无花果。1d 和 1e )。

图1
胎猪肠道球体在体外重新聚集的时间过程。
将球状体移植到肾下被膜中并在四周后收集。尽管移植后肉眼可见的白色球体由于血管生成而变成微红色，但大小几乎没有变化（无花果。2a 和 2b )。在组织学分析中，苏木精-伊红染色未证实粘膜和间质层的结构（图2c）。此外，无法确认阿尔新蓝阳性的粘膜杯状细胞（图2d），尽管αSMA阳性平滑肌细胞被证实（图2e）。总之，虽然球体被移植并供血，但没有观察到组织学成熟和发育。

图2
移植至免疫缺陷小鼠肾下被膜后4周，来自胎猪肠的球状体的组织学结果。粘膜和间质层的结构不清晰可见。
胎猪节段小肠组织移植
免疫缺陷小鼠肾包膜下移植
肾囊下移植后4周收获猪的节段胎儿肠组织。宏观上，它们被移植，提供血管并部分扩张，并形成囊肿（图3a）。移植的胎肠未见明显蠕动。组织学分析显示深部隐窝形成，与移植前的E30胎儿小肠相比，可见内外纵肌。无花果。1e和3b）。

图 3
将节段胎猪肠移植到免疫缺陷小鼠肾下被膜中获得的结果。
免疫缺陷小鼠的大网膜移植
对免疫缺陷小鼠进行网膜移植后四周和八周收获胎儿肠移植物。它们的最大直径从开始时的3毫米增加到第四周时的5毫米，并在第八周时增加到23毫米（图4a）。第八周时，在发育的移植物中观察到粘液样分泌物（图4b )，但在任何移植物中均未观察到明显的蠕动。

组织学分析显示，内环和外纵肌在第 4 周和第 8 周时均已分化（图 4c：四个星期，图5a：八周），揭示了深部隐窝的形成和杯状细胞的阿尔新蓝染色（无花果。5b和5c ) 移植后第八周。免疫组织化学染色显示，平滑肌层分化为两层结构，内、外纵肌均被 αSMA 染色。图5d）。此外，粘膜下层中 CD-31 阳性血管内皮细胞的存在证实了血管的成熟和发育（图5d）。

图4
体内大网膜移植后胎猪肠道的时间过程。
图5
移植到免疫缺陷小鼠大网膜后八周时胎猪肠道的组织学结果。
第八周移植物的隐窝比第四周深得多。平滑肌层分化为两层，第八周时观察到包括神经节细胞在内的成熟肠神经系统，但未观察到肠道蠕动波。证实了肌层内存在 S-100 阳性神经元纤维和肠神经丛，并且在奥尔巴赫神经丛中也观察到了神经节细胞（图5e )移植后第八周。

B6小鼠同基因网膜移植
作为对照，在 C57BL/6JJmsSlc 小鼠中进行同基因移植。最初，通过苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色对移植前 C57BL/6JJmsSlc 小鼠的胎儿节段小肠 (E13) 标本进行显微镜评估。标本具有由粘膜和间质层组成的两层结构（图6a）。到网膜移植后第4周，大小已从3毫米增大至9毫米，大于同一时间点的异种移植标本，并证实管腔通畅（图6b）。组织学分析显示深层隐窝和肌肉层分化为具有内部和外部纵向肌肉的两层结构（图6c）。免疫组织化学染色显示αSMA阳性和CD31阳性细胞，分别证实了肠平滑肌和血管内皮的存在，这表明该组织已分化。图6d）。

图6
胎儿小肠的组织学结果显示同基因移植后4周已成熟和发育。
讨论
在这项研究中，揭示了胎儿节段肠中粘膜层和肌肉层的显着体内成熟。相比之下，粘膜层和肌肉层不具有清晰的分层结构，并且在球状体移植中未观察到成熟。这是第一份比较猪异种移植到小鼠后胎儿节段肠组织和胎儿肠球体成熟情况的报告。

儿童期肠衰竭是一种具有挑战性且复杂的疾病，是由于短肠综合征（例如患有长段型先天性巨结肠的患者或因旋转不良肠扭转或坏死性小肠结肠炎导致的大肠切除患者）小肠功能不足而导致的。这些患者需要进行肠移植作为治愈性治疗，但免疫抑制和感染给移植带来了问题，导致早期尝试失败10。它通常仅限于因移植后出现严重并发症（如脓毒症、慢性肾病和淋巴组织增生性疾病）而患有危及生命的肠外或静脉营养并发症的患者。此外，由于移植物中含有大量淋巴组织，肠移植后比其他器官移植后更容易发生移植物抗宿主病11。因此，据报道总体 1 年和 5 年生存率分别为 60% 和 50%12-14，肠道移植仍然比其他类型的器官移植更具挑战性。

因此，HIO 作为治疗细胞来源最近引起了人们的关注。由于佐藤等人。建立了肠类器官中LGR5+肠上皮干细胞的体外三维培养体系15已有多种肠道类器官培养技术的报道16,17 号。然而，由于类器官在体内器官发生过程中发育的所有胚层衍生细胞之间并不表现出功能协调，因此在人类的临床应用中仍然存在各种问题。目前的人类上皮类器官最初是由内胚层用多种生长因子诱导而来，同时抑制其他胚层的形成15,16。此外，HIO 的小尺寸和囊状形状是需要解决的持续挑战18。

因此，我们重点关注胎猪肠道作为异种移植物和细胞来源，并比较球状体与胎儿节段组织移植后的体内成熟程度。猪在器官大小、解剖学和生理学方面与人类相似，被广泛用于移植研究。当使用胎猪肠道作为异种移植物或细胞来源时，大量的猪供应也是一个优势。此外，据报道，与成人分化器官相比，胎儿器官在移植时具有免疫学优势，特别是在肾脏环境中6，因此胎儿肠道组织有可能用于构建人类肠道，同时避免免疫反应。

我们的研究结果揭示了胎儿肠道组织的成熟优于球体。在移植的胎儿肠组织中观察到粘膜、平滑肌、神经节细胞和神经纤维的成熟，这表明胎儿节段肠可以在体内发育成熟，无需生长因子处理等人工操作，这与胚胎干细胞或诱导多能干细胞不同细胞。此外，胎猪器官在八周后变得更大，这在考虑用作移植物的材料时可能是一个优势。同时，球体在体内并未成熟或发育，尽管它们最初保留了与结构成熟相关的所有成分。我们推测，一旦组织被酶分解产生单细胞，相邻细胞之间的相互作用丧失，细胞的重新排列受到干扰。这些结果表明，分段胎儿肠可能比球体更适合作为异种移植的移植物。

为了与异种移植的发育大小和成熟度进行比较，本研究还在 C57BL/6JJmsSlc 小鼠中进行了同基因移植。移植后四周，同基因移植的移植物表现出充分的成熟，并且比移植到免疫缺陷小鼠的猪移植物长得更大。我们推测动物物种之间的成熟速度存在差异，因为猪的妊娠期为114天，而小鼠的妊娠期为20天。此外，同基因和异种移植之间的生长速率差异可能有所贡献，但很难解释由于物种差异而导致生长速率差异的确切机制。据报道，一些生长激素具有物种特异性，而另一些则没有，19。

关于宿主动物的移植部位，本研究进行了肾包膜下移植和大网膜移植，成熟度没有观察到明显差异。此前的许多报道表明，将胎鼠肠道移植到成年大鼠的皮下组织、大网膜和肾被膜中，可以实现血管化并在形态和功能上成熟20-23。对于大网膜移植来说，由于可以简单地包裹和卷起胎儿肠组织等小标本，因此在发育后与宿主肠道移植吻合的可行性方面具有优势；此外，移植物可以在非常靠近肠道的位置成熟和发育。另一方面，也有一个缺点：移植后由于身体运动，标本有迁移并退出大网膜的风险，特别是当标本较小时。肾囊下移植可能更适合小型移植物，例如球体。

本研究有几个局限性。我们无法验证胎儿肠道的免疫学优势，因为体内异种移植后的发育和成熟是本研究的主要焦点。尽管杨等人。揭示胎儿肠移植后不存在移植物抗宿主病，并提示胎儿肠组织作为移植物的潜在应用24，目前对胎儿肠道免疫优势的客观评价很少，此前在胎儿肾脏领域已有报道6,25。因此，需要进一步的研究，例如研究抗原呈递细胞或供体抗原的丰度，例如胎猪肠道中的主要组织相容性复合体。此外，虽然移植后观察到肠神经系统的成熟，但在本研究中无法确认有节奏的蠕动运动，而Nagy等人。观察移植到免疫缺陷小鼠体内的胎儿人肠移植物的自发蠕动活动26。需要对运动进行更多的定量和神经生理学分析来确认蠕动波，以评估正常肠神经系统的发育。

尽管胎儿肠道异种移植存在一些问题，但该研究揭示了节段组织与球体相比在成熟和发育方面的优越性。该模型中使用的腹内胎儿肠道异种移植物将成为创建具有免疫优势的肠道移植物的宝贵平台。

结论
揭示了小鼠胎猪节段肠组织的结构成熟和发育情况，为构建肠移植物提供了平台。相比之下，由胎儿肠道产生的球状体在移植到小鼠体内后并未在体内成熟。