介绍

畜牧生产系统使用饲料添加剂开发日粮配方，这些添加剂有可能通过增强或抑制特定微生物种群来改变瘤胃环境，益生菌已被用来增强瘤胃微生物群，瘤胃微生物群负责纤维素和半纤维素的降解，从而使反刍动物能够以牧场和饲料消耗为食。此外，益生菌可用于调节瘤胃发酵和天然微生物群，因为它们是潜在有用微生物的来源（Fraga 等，2014）。

用于反刍动物的微生物益生菌（酿酒酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌）可提高干物质摄入量和生产力。酿酒酵母很重要，众所周知，将其添加到日粮中可以提高劣质饲料的利用率（Shriver-Munsch 等，2011；Khattab 等，2020），提高纤维消化率并稳定瘤胃 pH 值（Moallem 等，2020）。 ，2009 年；Degirmencioglu 等人，2013 年；Meller 等人，2014 年；Khattab 等人，2020 年）。植物乳杆菌改善羔羊的营养摄入、生长性能和瘤胃发酵（Izuddin 等人，2019；Khattab 等人，2020）。乔等人。(2010)提到，羔羊体内的枯草芽孢杆菌可以减少腹泻的发生率，增加干物质摄入量和断奶前的每日体重增加。益生菌通过有益细菌的共生影响肠道，影响宿主健康，这也可能涉及生长刺激并有助于提高生产力（Markowiak & Ślizewska，2018）。

在厌氧状态下，生活在瘤胃中的微生物种群的浓度，特别是细菌、原生动物和真菌，分别为 10 10 个细胞/mL、10 6 个细胞/mL 和 10 4 个细胞/mL（Jouany，1994；Cardona-Iglesias 等人， 2017）。让有机体生长缓慢；如果真菌和瘤胃原生动物等要繁殖，饲料需要在瘤胃内长时间停留 48 至 72 小时，以维持微生物种群的浓度（McAllister 等，1994；Gharechahi 等，2021）。卡斯蒂略-洛佩兹和多明格斯-奥尔多涅斯 (2019)，卡斯蒂略-洛佩兹等人。（2014）和佩特里等人。(2012)报告称，通过使用高通量 DNA 测序，他们揭示了瘤胃中存在 13 个主要细菌门，其中包括 40 个细菌目、约 80 个细菌类、以及至少 180 个细菌科、约 320 个细菌属等超过 2,000 个可操作的细菌分类单位。瘤胃中的细菌密度范围为 107 至 1010 个细胞/mL 瘤胃液（ Castillo-Lopez 等，2014； Danielsson 等，2017）。最丰富的瘤胃细菌属是普雷沃氏菌属，占细菌群落的 20% ( Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez, 2019 )。

尽管原生动物属的数量比细菌少，但原生动物在物理上比细菌大，并且可能约占瘤胃微生物总生物量的一半。在原生动物中，已鉴定出 20 多种原生动物，其在瘤胃中的浓度约为 10 6 个细胞/mL 瘤胃液（Martin，1994；Bodas 等，2012；Castillo-Lopez 和 Domínguez-Ordóñez，2019）。

产琥珀纤维杆菌是草食动物胃肠系统中的优势菌种；它是一种革兰氏阴性厌氧细菌，能够大量降解纤维（Kobayashi，2006；Jun 等，2007）。这种细菌也是仅有的两种栽培物种之一，是一种有效的纤维素降解剂。具体而言，它对结晶纤维素具有特别高的活性，需要与该基材进行密切的物理接触（Suen 等人，2011）。因此，我们的目标是通过计数和终点 PCR 来识别和评估添加了微生物生物制剂 (PNC) 的羊与添加了微生物生物制剂 (PNC) 的羊中存在的瘤胃细菌和原生动物。商业益生菌 REVET ®(PCRE) 不同浓度。

材料与方法

动物实验设计

该实验在墨西哥萨卡特卡斯州 Juchipila 市的 El Remolino 社区进行，位于北纬 103°07'26.15'' 和西经 21°21'48.10'' 之间，海拔 1220 m。该研究在旱季进行（旱季（平均高温 38-40°C）从 3 月底开始，到 6 月第一场降雨结束。它包括 21 只正在生长的毛羔羊，每栏添加 Katahdin，补充不同剂量的非商业益生菌生物制剂，并将商业益生菌 REVET ®添加到水中，随意添加（ El -Sayed & Mousa，）。生长羊分为两组，分布情况如表1所示。饲喂基于碎玉米茬70%、碎苜蓿15%、玉米粒5%、糖蜜8%、碳酸氢盐1.5%、维生素和矿物质预混料0.1%、食盐0.4%的日粮。旱季前（3 月至 6 月），实验单位经历了 17 天的适应期。

微生物固体生物制剂（PNC）的制备

为了制备固体 PNC，将 40 千克麦麸、20 千克含有高效固体微生物（生物制剂）的森林益生菌（分解有机物）、0.5 千克糖蜜溶液在 5 升水中混合在塑料桶中，并用容量为100升。据Kyan 等人报道，该容器每两到三天打开一次，以释放 PNC 准备就绪 30 天内产生的气体。（1999）。

液体PNC的制备

为了制备液体 PNC，取 8 kg 固体 PNC，用毯子包裹并放入 100 L 水中和 5 kg 糖蜜中，静置两小时（Kyan 等，1999），然后到了可以使用的时候了。随后，通过使用播种在平板上的选择性培养基来表征微生物的含量。施用NCP包含：嗜温菌1.94x10 7 CFU/100mL、乳杆菌属sp。1.6x10 6 CFU/100mL，金黄色葡萄球菌4.2x10 4 CFU/100mL，念珠菌属。5.5x10 3 CFU/100mL，大肠杆菌1.18x10 6 CFU/100mL，真菌 4.0x10 5CFU/100mL 和酵母 4.27x10 7。表 1显示了不同处理中的 PNC 供应。

液体商业益生菌 REVET ® (PCRE)的制备

施用益生菌有助于羊肠道微生物的平衡，防止瘤胃功能障碍，增加微生物合成，维持瘤胃菌群的平衡和最佳条件。制造商推荐的剂量为羊每天 3 克，稀释在 6 升水中（100%），1.32 克稀释在 6 升水（66%）中，0.99 克稀释在 6 升水中（33 %）。根据供应商的规格，它含有嗜酸乳杆菌7.3x10 18 CFU/100mL、屎链球菌1.1x10 6 CFU/100mL和酿酒酵母3.6x10 11CFU/100mL。每天 08:00 将益生菌添加到 6 升水中。

获得瘤胃液体

瘤胃液通过连接在注射器上的0.5"、1m长的瘤胃探针获得。实验持续110天；其中采样次数为m1（时间0）、m2（30天）、m3（60天）收集大约30mL的瘤胃液。

细菌和原生动物的获取和定量

将得到的瘤胃液混合并过滤，得到均匀的样品并过滤。用移液器吸取瘤胃液 1 mL，加入 9 mL 10% 福尔马林盐水溶液，然后将样品冷藏备用，得到最后的溶液 2 mL，蒸馏水 8 mL。添加后，以 2000 xg 离心 20 分钟，从上清液中取出样品，在 Neubauer 室中在 Carl Zeiss 显微镜的支持下以 40X 进行计数。

PCR终点

通过终点PCR鉴定细菌总数、琥珀纤维杆菌和瘤胃厌氧真菌；该方法包括通过连接在注射器上的 0.5" 和 1m 长的探针获得瘤胃液体；该等分试样保存在 -20°C 下以供实验室后续处理。使用 MO 的 Ultra Clean 微生物 DNA 分离试剂盒进行 DNA 提取BIO Laboratories Inc 的定量是在分光光度计 (NanoDrop ND-1000 LabTech) 中进行的，考虑到 260/280 和 260/230 nm 的吸光度比来确定其纯度（Green 等人，2012 年；Daza 等人，2014 年）对从每个样品中提取的 DNA 进行稀释，以达到 50 ng/μL 等摩尔浓度。所用寡核苷酸的序列显示在表2另外还有每个片段的分子量。

结果与讨论

构成瘤胃生态系统的细菌、原生动物和真菌的营养需求和代谢有所不同( Bach et al., 2005 ; Rodríguez et al., 2007 ; Matthews et al., 2018 )。厌氧瘤胃细菌、原生动物和真菌降解纤维材料，使反刍动物能够利用植物纤维获取营养（Rodríguez 等，2007）。Rodríguez 等人认为，细菌是数量最多的微生物，与之前的微生物一样，在膳食纤维的生物降解中发挥着重要作用。（2012）指出，有许多细菌和酵母可以以有益的方式用于维持健康和平衡的消化菌群。

每六小时进行一次原生动物计数的结果，其中观察到100% PCRE处理在零时间呈现最低值（7.5x10 3 个细胞/mL），而一般平均值为10 5 个细胞/mL。

在内田等人的工作中。(1987)报道称，单个原生动物每小时可吸收多达 104 个细菌。这些估计表明，原生动物捕食可以在高原生动物密度（10 5至10 6）下更新瘤胃中的全部细菌生物量。补充 PNC 和 PCRE 的绵羊对原生动物和细菌种群有益。

卡方检验，其中观察到不同剂量的PNC与PCRE研究的细菌计数之间没有统计学上的显着差异（P<0.05）。唯一的比较显示了 PNC 100% 与 PCRE 66% 之间的差异，PCRE 66% 的差异更高。

补充 PNC 和 PCRE 的绵羊对原生动物和细菌种群有益。根据Williams & Coleman (2012)，原生动物的繁殖时间为 5-14 小时不等，与 PCRE 中的浓度时间一致，最大种群在 12 小时时达到 66%，在 18 小时时达到 33%，Jouany（ 1994)和Williams & Coleman (2012)发现几种瘤胃原生动物具有 α 淀粉酶，这种类型的淀粉分解活性最高的其中之一是Entodinium caudatum，同样，Mold & Thomas (1958)和Arcos-García 等人。 , (2007)等人在全食原生动物中发现了α和β淀粉酶，可促进植物储备糖和结构糖单位的分裂。

在营养部分，益生菌和肠杆菌竞争必需氨基酸和糖，减少有毒胺的产生，这可以通过对动物健康状况很重要的嗜酸乳杆菌来弥补（ Castillo-Lopez 等，2013）。瘤胃 107 和 1010 瘤胃液细胞中的细菌密度，最丰富的类菌门包括细菌总数的 75% ( Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez, 2019 )。

非商业益生菌（NCP）可以作为生长羊日粮的替代品，有必要表明，绵羊中的NCP可以用于优化动物整体日粮中的生产，而不会对生态造成负面影响，通过直接供应 NCP 和 PCRE 来实现。

关于对照处理记录的 DNA 浓度，获得的平均浓度为 58.36 ng/μL，最小值为 28 ng/μL，值为 100 ng/μL。表 9显示了获得的每个浓度以及 260/280 比率，这表明 DNA 纯度足以满足 PCR 方案的要求。

在补充CNP的绵羊中，在100%、66%和33%处理中，获得的基因组DNA的平均浓度分别为77.6 ng/μL、69.7 ng/μL和70.18 ng/μL（表9）。添加 PCRE 的羊瘤胃液微生物中获得的 DNA 浓度在 100% 中平均为 46.81 ng/mL，在 66% 中为 46.09 ng/mL，在 33% 中为 36.36 ng/mL。

瘤胃中总细菌的多样性在饲料降解和发酵过程中非常重要，因为这允许拥有多种酶以及精确的生化反应，有助于将植物材料水解成更简单的结构，并且可以为微生物和微生物提供更大的可用性。增加发酵产物（López et al., 2020）。

对于总细菌，PCR扩增条带对应于130bp，能够在对照凝胶中识别出该特征条带，其对应于图1(A)。根据这些结果，可以说，对总细菌适应效果最好的益生菌是PNC，因为它允许细菌微生物群在瘤胃中继续生长，因此不影响饲料降解和瘤胃发酵。

瘤胃细菌参与纤维素降解，该物种存在超过 100 个编码降解多糖的酶的序列（Morrison 等，2003；Jun 等，2007；Firkins，2021），其中大多数负责纤维素的降解。此外，这些细菌还降解植物壁的木聚糖、半纤维素和单糖（Mirón，1991；Hobson & Stewart，2012）。

结果表明，PCRE 在 100% 浓度下对Fibrobacter succinogenes具有抑制作用，因为与对照相比，没有观察到寡核苷酸 (121 bp) 的特异性条带，如图1 (H)所示，然而，对于浓度为 66% 和 33% 时存在该条带（图 1、J、K）。

瘤胃厌氧真菌在纤维饲料的消化中发挥着重要作用，因为它们具有很强的定殖木质纤维素壁、削弱纤维植物组织以及降解其细胞壁结构成分的能力（Galindo 等，2015）。 ，2017）。对于厌氧真菌 (120 bp)，补充任何浓度的益生菌均不会对其产生影响（图 1，P、Q、R、S、T、U）。

Rodríguez 等人认为，益生菌的作用似乎与参与瘤胃发酵和甲烷形成的微生物的机制和代谢过程有关。（2013）指出，有许多细菌和酵母可以以有益的方式用于维持健康和平衡的消化菌群。最常用的微生物是乳杆菌、屎链球菌、芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌，B. 蜡状体，B. 地衣状菌，B. 嗜热脂肪菌和S . 酿酒酵母。

乳酸菌在肠道中快速生长，可能是最著名的可将乳糖转化为乳酸的细菌。乳酸的增加会降低肠道 pH 值，从而影响对瘤胃菌群、病原体等不利的微生物的生存。

结论

这种非商业益生菌可以通过增加细菌和原生动物来补充墨西哥萨卡特卡斯州胡奇皮拉峡谷地区生长的绵羊的饮食。益生菌是一种可以成功使用的添加剂，因为它不会改变瘤胃中细菌和厌氧真菌的总数。