番茄红素通过抑制氧化应激、细胞衰老和 SASP 改善 SAMP6 小鼠的骨质量

范围
细胞衰老（CS）与包括骨老化在内的组织衰老密切相关。CS和衰老相关分泌表型（SASP）已成为老年骨质疏松症的关键发病机制要素。本研究旨在探讨番茄红素对老年骨质疏松症的影响。

方法和结果
衰老加速小鼠易于6（SAMP6）品系小鼠被用作老年骨质疏松症模型。连续 8 周每天摄入番茄红素可以保持 SAMP6 小鼠的骨量、密度、强度和微结构。此外，这些改变与老年骨质疏松症模型中氧化应激的减少有关。此外，SAMP6 小鼠骨组织中的成骨细胞和骨细胞衰老以及 SASP 有所减少。番茄红素可以改善骨骼健康，这可能是由于其抗氧化特性，该特性可能与 SAMP6 小鼠中 CS 和 SASP 的调节有关。

结论
这些结果表明，番茄红素可能通过抑制氧化应激、CS 和 SASP 有益于治疗老年骨质疏松症。

1 简介
骨质疏松症是一种全身性疾病，其特征是骨量减少和骨微结构恶化，导致骨脆性增加和骨折倾向增加。[ 1 ]越来越多的证据表明骨质疏松症是一种与年龄相关的进行性骨病，并且衰老与骨质疏松症之间存在明显的关联。[ 1 - 3 ]此外，由于潜在的并发症，老年人骨折后的愈合潜力降低[ 4 , 5 ]并且死亡率升高。[ 6 ]

衰老是生物体的一个共同特征。随着衰老，许多细胞类型的细胞衰老（CS）都会增加。[ 7 - 9 ] CS 的特点是稳定的细胞增殖停滞以及基因表达谱的改变，导致衰老相关的分泌表型 (SASP)。[ 10-12 ] SASP 包含衰老细胞 (SC) 分泌的功能障碍因子，包括趋化因子、细胞因子、细胞外基质降解蛋白、生长因子和其他生物活性因子。[ 13 , 14 ]通过创造有毒的微环境，SASP 会影响邻近细胞的功能并产生额外的 SC。[ 15 , 16 ]

CS与一些慢性疾病有关，例如糖尿病、[ 17 ]动脉粥样硬化、[ 18 ]和骨质疏松症。[ 1 , 19 ]赫比格等人。据报道，相对较低数量的 SC（10-15%）足以造成老年灵长类动物的组织损伤。[ 20 ]将 SC 注射到年幼动物体内会导致一些与年龄相关的疾病过早发病。[ 21 ]法尔等人。还报道说，随着衰老，骨微环境中的多种细胞类型会衰老并产生 SASP。[ 13 ]其他研究人员也观察到 p16 Ink4a表达在与年龄相关的骨质疏松小鼠中急剧增加。[ 22 , 23 ]与年轻雄性小鼠相比，老年小鼠骨骼中的衰老骨细胞和髓样细胞增多。[ 24 , 25 ]阿基诺-马丁内斯等人。还报道称，老年小鼠牙槽骨中的衰老骨细胞增加，导致与年龄相关的牙槽骨流失。[ 26 ]事实上，随着年龄的增长，在老年女性的骨组织中发现了 p16 Ink4a、 p21 Cip1和多种 SASP 因子的增加。[ 27 ]因此，SCs是导致衰老相关疾病（包括骨质疏松症）的主要候选者。

SC 的清洁代表了一种疾病缓解的新治疗方法。使用遗传方法或药理学方法消除 SC 可延长健康寿命并减少与年龄相关的疾病，包括骨质疏松症。[ 28 - 31 ]在转基因动物中，发现 SC 的清除伴随着更好的骨量、微结构以及股骨和脊柱的生物力学强度。[ 28 ]先前的一项研究报道，达沙替尼（D）和槲皮素（Q）的组合可有效去除SCs，改善股骨和椎骨微结构，并增加老年小鼠的骨矿物质密度（BMD）。[ 28 ]此外，老年小鼠 MSC 的成骨能力下降可以通过补充 D+Q 来纠正。[ 32 ]我们还报道，膳食补充吡咯喹啉醌（PQQ）（一种天然抗氧化剂）可以通过抑制CS和SASP来预防卵巢切除术（OVX）引起的骨质流失并提高骨强度。[ 1 ]

作为一种膳食类胡萝卜素，番茄红素以其高抗氧化能力而闻名。[ 33 , 34 ]先前的研究表明，在动物和临床研究中，番茄红素可以改善血糖和脂质代谢。[ 35 ]大量研究表明番茄红素可能调节骨代谢。体外研究表明，补充番茄红素可以增加成骨细胞生成[ 36 ]并抑制破骨细胞生成。[ 37 ]动物研究表明番茄红素可以增加BMD，[ 38 ]并降低 OVX 大鼠的骨脆性。[ 39 ]临床研究表明，老年女性血清番茄红素与骨量之间存在反比关系。[ 40 , 41 ]一项流行病学研究还报道，补充番茄红素与绝经前女性的全身骨矿物质含量（BMC）和 BMD 之间存在显着相关性。[ 42 ]同样，绝经后妇女摄入番茄红素（30 mg d -1）4个月可降低血清NTx水平。[ 43 ]另一项研究也揭示了番茄红素对髋部骨折的保护作用。[ 44 ]总之，所有这些观察结果表明番茄红素具有骨骼保护特性。

然而，食用番茄红素可以预防老年骨质疏松症的可能性仍然难以捉摸，需要更多的研究。因此，本研究利用衰老加速小鼠品系6（SAMP6）小鼠作为老年骨质疏松症模型，分析补充番茄红素对骨量、密度、微结构和强度的影响，并评估其潜在机制。

2 实验部分
2.1 实验设计
所有动物程序均按照中国科技部实验动物护理和使用指南的要求进行，并经徐州医科大学邳州医院伦理委员会批准。三个月大的雄性 SAMP6 ( n = 20) 和 SAMR1 ( n = 10) 小鼠购自 Jackson 实验室（中国北京），并在恒温（24 ± 1 °C）和湿度（50% ± 10%）和 12:12 小时的光/暗周期。所有小鼠均提供标准AIN-93G饮食和随意饮水。

番茄红素购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。SAMP6 小鼠被随机分配接受番茄红素（SAMP6+LYC，n = 10）或玉米油（SAMP6+Veh，n = 10），为期 8 周。SAMR1 小鼠（SAMR1+Veh，n = 10）用作同源对照。SAMP6+LYC组的小鼠用溶解在玉米油（10 mg番茄红素·mL -1 ）中的番茄红素（50 mg kg -1 天-1）灌胃，而其他组的小鼠则用玉米油（5 mL kg -1 ）灌胃。 1 天-1 )。

2.2 DXA 分析
使用双能X射线吸收仪（DXA，Lunar Corp.，Madison，WI，USA）检测体内胫骨、股骨、脊柱和全身的骨矿物质密度（BMD）和骨矿物质含量（BMC）正如之前报道的那样。[ 45 ]

2.3 胫骨的微计算机断层扫描 (μ-CT) 分析
如前所述，对左股骨进行 μ-CT 扫描。[ 45 ]使用 NRecon 软件（Skyscan，比利时）分析感兴趣体积中的以下参数：小梁骨体积/总体积（BV/TV，%）、小梁数量（Tb.N，1 mm -1）、小梁骨体积厚度（Tb.Th，μm），小梁骨表面/骨体积（BS/BV，1 mm -1），小梁间距（Tb.Sp，μm），皮质厚度（Ct.Th，μm），皮质体积（Ct） .V，mm 3）和皮质面积（Ct.Ar，mm 2）。

2.4 三点弯曲试验
如先前报道，使用商业机械测试设备（Bose Electro Force 3220；Bose Corp.，美国）。[ 45 ]左股骨的全骨结构特性，包括最大载荷（N）、屈服载荷（N）、极限位移（μm）、屈服位移（μm）、刚度（N mm -1）和能量吸收（ N mm)，是从这些载荷-位移曲线中获得的。

2.5 纳米压痕
清洁过程后，将股骨安装在纳米压痕系统（Agilent G200，Agilent Technologies Inc.，美国）上。自动记录力-位移曲线，并根据先前描述的方法计算骨小梁弹性模量（GPa）和接触硬度（GPa）。[ 45 ]

2.6 血清生物标志物分析
T-AOC、SOD、MDA、ALP、P1NP、CTX-1 和 TRACP5b 的血清水平使用商业试剂盒（中国南京建成生物科技有限公司）根据制造商的方案测定。[ 45 ]

2.7 组织学和组织形态计量学
为了评估动态指数，在处死前12天和2天给小鼠注射钙黄绿素（C0875，Sigma，10 mg kg -1 ，腹膜内）。动态骨小梁组织形态计量参数包括矿物质沉积率（MAR，μm day -1）、矿化表面/骨表面（MS/BS，%）和骨形成率/骨表面（BFR/BS，μm 3  µm）-2 天-1 )如之前报道的那样确定。[ 45 ]

右胫骨采用苏木精和伊红（H&E）、Von Kossa、碱性磷酸酶（ALP）、甲苯胺蓝、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，并按照静态指标分析常规程序进行。[ 45 ]

2.8 免疫组织化学 (IHC) 分析
IHC 染色如前所述进行，[ 45 ]使用一抗 p16 (1:200)、p21 (1:100)、p53 (1:100)、b-gal (1:100) 和 γH2A.X（ 1:100）从 Abcam Biocompany（美国马萨诸塞州剑桥市）获得。

2.9 蛋白质印迹分析
如前所述制备蛋白质样品并转移到膜上。[ 45 ]一抗如下：p16（1：500）、p21（1：1000）、p53（1：500）、Sirt1（1：500）和GAPDH（1：2000）。使用 ImageJ 软件对 Azure 生物成像系统捕获的图像进行量化，并使用相应的 GAPDH 进行标准化。

2.10 RNA分离和定量实时PCR
处死动物后，小心取出左胫骨的软组织和肌肉（每组n = 10）。分离总 RNA，并在 ABI 7500 序列检测系统（Thermo-Fisher，Waltham，MA，USA）上进行实时 PCR。持家基因 GAPDH 作为内部对照。所有引物均由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司（中国南京）设计和订购。引物序列列于表 1中。

表 1. qRT-PCR 的引物序列。
姓名    向前    撤销
碱性磷酸酶    CCTAGACACAAGCACTAACACTA    GTCAGTCAGGTTGTTCCGATTC
骨形态发生蛋白2    GAATGACTGGATCGTGGCACCTC    GGCATGGTTAGTGGAGTTCAGGTG
科尔-1    CCCTACTCAGCCGTCTGTGC    GGGTTCGGGCTGATGTACC
光学网络    GCCTTCATGTCCAAGCAGGA    GCGCCGGAGTCTGTTCACTA
操作系统X    CATCTAACAGGAGGATTTTGGTTTG    AAGCCTTTGCCCACCTACTTTT
运行X2    CTGTGGTTACCGTCATGGCC    GGAGCTCGGCGGAGTAGTTC
CTSK    CTTCCAATACGGTGCAGCAGA    TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC
陷阱    CACTCCCACCCTGAGATTGT    CCCAGAGACATGATGAAGTCA
兰克    CAGCATCGCTCTGTTCCTGTA    CTGCGTTTTCATGGAGTCTCA
OPG    ACCCAGAAACTGGTCATCAGC    CTGCAATACACACACTCATCACT
超氧化物歧化酶1    CGTCATTCACTTCGAGCAGAAGG    GTCTGAGACTCAGACCACATA
超氧化物歧化酶2    GGCCAAGGGATGTTACAA    GCTTGATAGCCTCCAGCAAC
GPX1    GGGACCTCGTGGACTGGTGGTGCT    CCCGCCACCAGGTCGGACGTACT
GPX2    CGCCTGGTAGTTCTCGGCTTCCCTT    GGGCTGGTACCCACCCCCCAGGT
TXNRD1    卡嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎    GCACATTGGTCTGCTCTTCA
prx2    ACGAGCATGGGGAAGTTTGT    GCCTTTCCTGGGTCAGCATA
prx4    GTTACCAACGAAAACCGGCG    CCCAATCCTCCTGCTTTACGA
HO1    GAGGCTAAGACCGCCTTCCT    TTGTGTTCCTCTGTCAGCATCAC
过氧化氢酶    GTGCCCCCAACTATTACCCC    GAATGTCCGCACCTGAGTGA
NQO1    嘎嘎猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫猫    嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎
NRF2    GCCTTGTACTTTGAAGACTGTATGCA    AAGCGACTCATGGTCATCTACACAT
克洛托    TGTGAATGAGGCTCTGAAAGC    GAGCGATCACTAAGTGAATACG
PPAR-g    TCGCTGATGCACTGCCTATG    嘎嘎嘎特卡卡嘎嘎特加特
脂肪酶    TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA    CCAACCTGCACAAGTTTCCCTT
FABP4    AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT    TCACGCCTTTCATAACCATCC
塞布巴    GCGGGAACGCAACAACATC    GTCACTGGTCAACTCCAGCAC
麻风病    TGGTCCCAGCAGCTATGGT    ACCCAGAGAAGTTAGCACTGT
白细胞介素1a    CGAAGACTACAGTTCTGCCAT    GACGTTTCAGAGGTTCTCAGAG
白细胞介素1b    CTGGTACATCAGCACCTCAC    AGAAACAGTCCAGCCCATAC
白细胞介素6    TGTATGAACAACGATGATGCACTT    ACTCTGGCTTTGTCTTTCTTGTTATCT
白细胞介素8    AACTTCTCCACAACCCTCTG    TTGGCAGCCTTCCTGATTTC
HGF-1    GGGGACGATACTGTCCTGAA    GTCCCTCAGTGCACATCTCA
基质金属蛋白酶3    CAAAACATATTTCTTTGTAGAGGACAA    TTCAGCTATTTGCTTGGGAAA
基质金属蛋白酶13    ACTTTTGTTGCCAATTCCAGG    TTGAGAACACGGGGGAAGAC
肿瘤坏死因子a    AGTGACAAGCCTGTAGCCC    GAGGTTGACTTTCTCCTGGTAT
P16    CCCGATTCAGGTGATGATGAT    GCGGGAGAGTAGTGGG
MCP-1    TCACCTGCTGCTACTCATTC    AGTGGATGCATTAGCTTCAG
甘草酸脱氢酶    TGGATTTGGACGCATGGTC    TTTGCACTGGTACGTGTTGAT
2.11 统计分析
所有数据统计分析和图表均使用GraphPad Prism 8.0分析软件(La Jolla, CA, USA)进行，数据表示为平均值±标准误差(SD)。使用单向方差分析（ANOVA）评估三组之间的差异。比较的统计显着性设定为p < 0.05。

3 个结果
3.1 番茄红素保留 SAMP6 小鼠的骨密度、质量和微结构
如前所述，[ 1-3 , 45 ]使用双能X射线吸收法（DEXA ）检测动物的BMD和BMC 。如图 1A所示，DEXA结果显示，与SAMR1对照小鼠相比，全身、腰椎、股骨和胫骨的BMD和BMC显着降低。然而，与 Veh 治疗组相比，用番茄红素治疗的 SAMP6 小鼠的 BMD 和 BMC 有所改善（图 1A）。为了检查番茄红素是否可以保护 SAMP6 小鼠的骨微结构，对左侧股骨进行了 μ-CT 检测（图 1B）。μ-CT 图像显示，与 SAMR1 组相比，SAMP6 小鼠的皮质骨和小梁骨丢失。显微组织参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Ct.Th、Ct.V、Ct.Ar严重下降，而Tb.Sp、SMI则上升SAMP6-Veh 组与 SAMR1 组相比。有趣的是，补充番茄红素部分减弱了上述 SAMP6 小鼠股骨骨微结构的变化。与SAMP6-Veh组相比，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Ct.Th、Ct.V和Ct.Ar值增加，但Tb减少。 SAMP6-番茄红素组中的 Sp 和 SMI（图 1B）。这些结果表明番茄红素在老年骨质疏松动物模型中具有体内抗骨质疏松作用。

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图1
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番茄红素减轻了 SAMP6 小鼠的骨量损失。A) 通过 DXA 测量胫骨、股骨、脊柱和全身的 BMD 和 BMC 值。B) 不同组别左股骨代表性μCT图像，以及μCT分析股骨远端骨参数，包括BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI、Ct.Th 、Ct.V 和 Ct.Ar。C) 左股骨三点弯曲结果，包括最大载荷、屈服载荷、极限位移、屈服位移、能量吸收和刚度。通过纳米压痕测试获得股骨固有的生物力学材料特性，包括组织级硬度和模量。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，p与指定组相比，< 0.001。
3.2 番茄红素保留 SAMP6 小鼠的骨强度
为了进一步评估番茄红素对股骨生物力学结构和材料特性的作用，对小鼠股骨进行了三点弯曲试验和纳米压痕测试。[ 1 - 3 , 45 ]如图 1C所示，SAMP6-Veh组小鼠的极限载荷、最大载荷、屈服载荷、屈服位移、刚度、能量吸收、极限位移、模量、硬度均显着低于SAMR1组。正如预期的那样，SAMP6 小鼠摄入番茄红素抑制了股骨这些参数的下降。这些结果表明，番茄红素不仅维持了老年骨质疏松动物模型的骨量、密度和微观结构，而且还提高了骨的生物力学强度。

3.3 番茄红素保留 SAMP6 小鼠的成骨骨形成
先前对衰老骨活检的组织形态计量学分析表明，成骨受损是年龄相关性骨质疏松症的主要原因。[ 46 ]在本研究中，进行了甲苯胺蓝和ALP染色（图 2A）。与 SAMR1 对照组相比，SAMP6-Veh 组的 N.Ob/BS、Ob.S/BS 和 ALP 阳性面积/组织面积显着减少。如之前报道的那样，通过双钙黄绿素染色对 MAR、BFR 和 MS/BS 进行骨动态组织形态计量学分析。[ 1 ]我们的结果显示，小梁骨处的新骨形成显着减少，如 MAR、BFR 和 MS/BS 的减少所反映（图 2A）。此外，通过 RT-PCR 评估 Runx2、Osterix、骨钙素 (OCN)、Col-1、BMP-2和ALP的 mRNA 水平（图2B）。SAMP6-Veh 组小鼠中这些成骨基因的表达显着下调。与 SAMP1 对照小鼠相比，SAMP6-Veh 小鼠的 OCN、ALP、Col-1、osterix 和 Runx2 蛋白表达水平一致下降，而硬化素蛋白表达水平增加（图 2C）。然后我们分析了血清中 ALP 和 P1NP 的水平，这些水平反映了成骨细胞骨形成的水平。我们的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果表明，SAMP6-Veh 组的 ALP 和 P1NP 浓度显着低于 SAMR1 组（图 2D）。然后我们进行 IHC 染色，发现 SAMP6-Veh 组的 Runx2、OCN 和 Osterix 阳性细胞明显低于 SAMR1 组（图 2E）。预计补充番茄红素可显着改善这些参数。我们的结果表明，补充番茄红素可增加成骨细胞的骨形成，从而预防老年骨质疏松动物模型中与年龄相关的骨质流失。

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图2
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番茄红素保留了 SAMP6 小鼠的成骨性骨形成。A) 通过托鲁丁蓝、ALP 和钙黄绿素双标记评估成骨细胞发生。N.ob/bs、ALP 阳性面积/总面积、MAR、MS/BS 和 BFR 的组织形态计量学分析。B)进行实时RT-PCR以确定左胫骨中成骨相关基因的mRNA表达。C)Western blot检测骨钙素、ALP、Col-1、Osterix、RUNX2、SOST蛋白表达水平。GAPDH 用作内部对照。D)通过ELISA测定血清ALP和P1NP。E) RUNX2、骨钙素和 Osterix 的 IHC 染色。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，与指定组相比，p < 0.001。
3.4 番茄红素抑制 SAMP6 小鼠破骨细胞骨吸收
由于破骨细胞活性增强而导致的过度骨吸收是衰老相关骨质流失的一个主要原因。[ 1 ]如图 3A所示，通过TRAP染色鉴定OC的数量。SAMP6-Veh 组的小鼠股骨中 OC 数量增加。与 SAMR1 对照组小鼠相比，SAMP6-Veh 组小鼠的 N.OC/BS、ES/BS 和 OC.S/BS 均显着增加。此外，与SAMR1对照组相比，血清CTX-I和TRAP-5b（骨吸收标志物）急剧增加（图 3B）。此外，TRAP、组织蛋白酶 K (CTSK ) 和RANKL的基因表达水平与 SAMR1 对照组小鼠相比，SAMP6-Veh 小鼠的 OPG均显着增加，而OPG 下降（图3C）。所有这些结果表明持续的骨吸收增加。值得注意的是，施用番茄红素减弱了这一趋势。这些结果表明，在老年骨质疏松动物模型中，番茄红素挽救的与年龄相关的骨质流失与破骨细胞骨吸收减少有关。

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图3
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番茄红素抑制 SAMP6 小鼠破骨细胞骨吸收。A)通过TRAP染色评估破骨细胞生成。N.OC/BS、ES/BS 和 OC.S/BS 的组织形态计量学分析。B)通过ELISA测量血清TRAP-5b和CTX-1。C)进行实时RT-PCR以确定与破骨细胞生成相关的基因的mRNA表达。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，与指定组相比，p < 0.001。
3.5 番茄红素改善 SAMP6 小鼠的脂肪生成
衰老引起的骨质流失的特点是骨髓腔内脂肪细胞增多，骨量减少。[ 1 ]股骨H&E染色显示，与SAMR1对照组相比，SAMP6-Veh组股骨近端脂滴更加明显，脂肪细胞数量和面积增加（图 4A）。进一步的蛋白质印迹分析还显示，与 SAMR1 对照组相比，SAMP6-Veh 小鼠股骨中脂联素、瘦素和 PPARγ 的蛋白表达显着增加（图 4B）。基因表达分析还表明PPARγ、脂联素、瘦素、相对于 SAMR1 对照组， Fabp4、C/ebpa和瘦素在 SAMP6-Veh 组中显着上调（图 4C）。有趣的是，番茄红素治疗显着减少了脂肪细胞的积累，并下调了脂肪生成相关基因的表达。

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图4
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番茄红素改善了 SAMP6 小鼠的脂肪生成。A)通过HE染色评估脂肪生成。脂肪细胞 Ar/BM.Ar 和 N.脂肪细胞/BM.Ar 的组织形态计量学分析。B)Western blot检测脂联素、瘦素、PPARγ蛋白表达水平。GAPDH 用作内部对照。C)进行实时RT-PCR以确定骨组织中与脂肪生成相关的基因的mRNA表达。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，与指定组相比，p < 0.001。
3.6 番茄红素减轻 SAMP6 小鼠的氧化应激
在衰老过程中，过量的活性氧导致的氧化应激会增加。[ 1 , 47 ]氧化应激敏感指标 8-OhdG 的 IHC 染色显示，SAMP6-Veh 组小鼠中的 8-OhdG (+) 细胞显着高于 SAMR1 对照小鼠（图5A  ）。与 SAMR1 对照组小鼠相比，SAMP6-Veh 组小鼠的抗氧化酶（包括 Prdx1 和 SOD1）的蛋白质表达水平显着降低（图 5B）。此外，与 SAMR1 对照组相比，SAMP6-Veh 组的 T-AOC 和 SOD 血清水平降低，MDA 血清水平升高（图 5C ））。我们还检查了骨髓、脾脏和胸腺中的 ROS 水平。与 SAMR1 对照组相比，SAMP6-Veh 组的 ROS 水平显着升高（图 5D）。与SAMR1对照组相比，SAMP6-Veh小鼠骨中抗氧化酶（SOD1/2、GPX1/2、过氧化氢酶、HO1、Prdx2/4、Nrf2、Txnrd1和NQO1 ）基因表达水平显着下调。小鼠（图 5E）。然而，补充番茄红素可以部分挽救这些参数。这些结果表明番茄红素可以减轻 SAMP6 小鼠的氧化应激。

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图5
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番茄红素减轻了 SAMP6 小鼠的氧化应激。A) 8-OHDG（氧化应激的敏感指标）的 IHC 染色。B)Western blot检测Prdx1、SOD1等抗氧化酶蛋白表达水平。GAPDH 用作内部对照。C)通过ELISA测量血清MDA、总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。D) 骨髓、脾脏和胸腺中的 ROS 水平。E)进行实时RT-PCR以确定骨组织中与氧化应激相关的基因的mRNA表达。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，与指定组相比，p < 0.001。
3.7 番茄红素抑制 SAMP6 小鼠的 CS
衰老伴随着多种细胞类型的 CS 增加。[ 7-9 ] IHC染色显示，p16、p21、p53、β-gal和γH2A.X（均为衰老标志物）阳性成骨细胞（图 6A ）和骨细胞（图 6B ）的百分比均显着增加。 SAMP6+Veh组小鼠与SAMR1对照组小鼠进行比较。我们的观察还表明，与 SAMR1 小鼠相比，SAMP6 小鼠中表达 p16+ 和 RUNX2+ 的细胞数量显着增加。值得注意的是，番茄红素的应用导致此类细胞计数显着减少（图 6C）。此外，SAMP6小鼠胫骨中γH2A.X、p16、p21、p53和β-gal的表达水平显着增加，而Sirt1和BMI-1（均为抗衰老标志物）显着降低-Veh 组与 SAMR1 对照组相比（图 6D）。与SAMR1对照组小鼠相比，SAMP6+Veh组小鼠的血清IL-6、IL-1α和TNF-α水平均显着升高(图 6E )。此外，SASP 标记物（IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL2、Mmp3、Mmp13、TNF-α、P16和与SAMR1对照组小鼠相比，SAMP6+Veh组小鼠的 Mcp1 )均显着增加(图6F )。然而，补充番茄红素可以部分挽救这些参数。这些结果表明，衰老伴随着骨组织中CS的增加，而番茄红素抑制SAMP6小鼠中的CS和SASP。

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图6
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番茄红素抑制 SAMP6 小鼠的 CS 和 SASP。A、B) 骨组织中 p16、p21、p53、β-gal 和 γH2A.X 的 IHC 染色。C) 代表性 p16 和 RUNX2 免疫组织化学。D)Western blot检测γH2A.X、p16、p21、p53、Sirt1、BMI1蛋白表达水平。GAPDH 用作内部对照。E)通过ELISA测量血清IL-1α、IL-6和TNF-α。F)进行实时RT-PCR以确定与SASP相关的基因的mRNA表达。值表示为平均值±SD，每组n = 10。*，p <0.05；**，p < 0.01；***，与指定组相比，p < 0.001。
4。讨论
在这项研究中，我们发现番茄红素干预逆转了 SAMP6 小鼠骨量、密度、微结构和生物力学强度方面与衰老相关的变化。此外，番茄红素治疗可抑制 SAMP6 小鼠的氧化应激。我们还提供了令人信服的证据，表明番茄红素通过抑制 CS 和 SASP 改善骨代谢。

以生理速度自然衰老的小鼠更能反映人类的衰老过程。这提供了对老年骨质疏松症如何发展的更精确描述。涉及这些自然衰老小鼠的研究通常需要更长的时间来观察类似骨质疏松症的显着变化，从而延长了研究项目的时间。其中，SAMP6 小鼠经常被用作研究老年骨质疏松症（一种以与年龄相关的骨质流失为特征的疾病）的模型。尽管它具有加速衰老表型、一致性、可重复性、骨质疏松症样变化早期发生以及明确的遗传背景等优点，但也存在缺点，包括其对人类衰老的适用性有限、骨质流失速度不自然、和有限的可用性。[ 48 - 50 ] 4 个月后，SAMP6 出现骨髓成骨缺陷、皮质内矿化表面缺陷、[ 51 ]钙和磷水平降低、[ 52 ]以及整体 BMD 较低。[ 53 ]与之前的研究一致，我们的数据表明，24周时SAMP6小鼠的BMD、BMC（图 1A）和骨生物力学强度（图 1C）低于SAMR1小鼠，导致骨折风险增加。

与之前发表的作品一致，[ 40 , 41 ]我们的数据表明，补充番茄红素可减轻 SAMP6 小鼠的老年骨质疏松症。这项研究的结果表明，补充番茄红素增加了SAMP6小鼠的BMD和骨强度，这些变化对于预防骨质疏松性骨折起到了有益的作用。此外，补充番茄红素可增加 BV/TV、MAR、MS/BS、BFR、血清 P1NP 和 ALP 水平以及成骨相关基因的表达，表明补充番茄红素在骨形成的积极作用中发挥着关键作用。男女都会出现与衰老相关的骨质流失。由于成骨细胞发育不全，老年骨质疏松症导致小梁骨和皮质骨的厚度显着减少。[ 54 ]对老年患者骨的组织形态学分析表明，与破骨细胞骨吸收相比，成骨细胞骨形成受损是老年骨质疏松症的根本原因。[ 46 ]骨形成的增加一致与骨吸收的增加相关。有趣的是，本研究发现骨形成增加但骨吸收指数没有增加（图 3A）。此外，SC 的清除还导致骨髓脂肪细胞的数量和面积显着降低（图 4A）。

为了应对压力，当细胞失去增殖和分化的能力时，就会发生 CS。[ 10 - 12 ] SCs释放SASP因子，形成有毒微环境并影响邻近细胞和SCs本身的功能，从而促进额外SCs的产生和积累。[ 15 ]体外研究表明，SCs 产生的条件培养基可抑制成骨细胞矿化。这些数据表明 SC 和 SASP 可能在老年骨质疏松症中发挥关键作用。[ 28 ] SC 和 SASP 的存在已在老年小鼠（24 个月）中得到证实。[ 13 ]法尔等人。有报道称，通过体内消除SCs可以减轻老年骨质疏松症。[ 13 ]去除一小部分（约 30%）的 SC 可减轻或预防多种与年龄相关的疾病，包括老年小鼠的骨质疏松症。[ 29 - 31 ]

与之前发表的研究结果一致，与 SAMR1 小鼠相比，SAMP6 小鼠的 SC 和 SASP 显着增加。我们首先在实验环境中证实衰老是否会导致骨细胞和成骨细胞的衰老和功能障碍。SA-β-Gal、γH2A.X、p16、p21和p53是最具代表性的衰老标志物。IHC 染色显示衰老诱导骨细胞和成骨细胞衰老（图 6A-C）。先前的研究还报道，成骨细胞衰老的增加会导致成骨细胞与年龄相关的功能缺陷。[ 46 , 55 ]SAMP6 小鼠中 p16、p21、p53 和 SA-β-gal 的 mRNA 和蛋白水平显着增加。Sirt1和BMI-1这两种抗衰老标记物的表达在SAMP6小鼠中显着下降（图 6D，E）。SASP 可以作为负效应子，导致衰老生物体中的慢性炎症和与年龄相关的疾病。[ 56 , 57 ]关键促炎细胞因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL2、MMP3、MMP13、TNF-α和MCP1，已被确定为 SASP 最重要的组成部分。[ 1,45,58 ]在我们的研究中，几乎所有这些因素在 SAMP6 小鼠中均显着 增加（图6F ）。鉴于骨细胞和成骨细胞是骨重塑的关键因素，衰老骨细胞和成骨细胞的作用及其产生的SASP因子可能有助于解释老年骨质疏松症的发病机制。

在衰老过程中，过量的活性氧导致的氧化应激会增加。[ 47 ] ROS 被描述为 CS 进展的重要介质。[ 1 , 59 ]随着年龄的增长，骨中ROS的积累会加速成骨细胞的衰老和功能障碍，[ 60 ]抑制成骨细胞的形成，[ 61 ]并增强破骨细胞的吸收，这些都可能导致骨质疏松。[ 62 - 65 ]根据先前的研究，衰老本身是骨量和强度减少的主要决定因素，[ 66, 67 ]越来越多的证据表明，生理机体衰老的氧化应激是老年骨质疏松症的重要致病机制。[ 68 , 69 ]事实上，我们发现 SAMP6 小鼠表现出氧化应激增加。本研究中，老年骨质疏松模型中骨髓、脾脏和胸腺中ROS水平显着升高（图 5D）。此外，基因（ SOD1、 SOD2、 Gpx1、 Gpx2、过氧化氢酶、 GSR、 HO1、 Prx-2、 Prx-4SAMP6小鼠中骨组织中抗氧化酶的蛋白（PRDX1 和 SOD1）表达水平显着下调（图 5B，E ）。据报道，番茄红素通过其抗氧化特性发挥骨骼保护作用。[ 33 , 34 ]有趣的是，给 SAMP6 小鼠补充番茄红素 8 周可以减轻氧化应激。这些结果都表明番茄红素具有通过调节SAMP6小鼠氧化应激来改善骨质量的能力。

总之，我们的研究结果表明，补充番茄红素可以改善 SAMP6 小鼠的骨量、微观结构、生物力学和力量。值得注意的是，我们证明番茄红素干预可抑制老年骨质疏松小鼠模型中破骨细胞骨吸收和脂肪生成的升高，并促进成骨细胞骨形成。其潜在机制可能与 ROS 加速的 CS 和 SASP 的调节有关。这些观察结果表明，饮食中摄入番茄红素可能为治疗与衰老相关的骨质疏松症提供一种新的治疗策略。