介绍
4 亿多年前，植物从水生生态系统向陆地生态系统的转变[ 1 ]，标志着地球历史上的一个决定性时刻。这一转变的特点是植物体计划的彻底转变，包括孢子体优势的建立和特定器官（如根、叶、花、种子和维管系统）的发育。陆地环境的成功殖民需要多细胞器官的进化，这些器官能够主动穿透土壤，吸收和运输对植物生长至关重要的水、养分和信号化合物。高效传导（血管）组织的发展在此过程中发挥了至关重要的作用[ 2]。维管组织负责运输水、养分、光合产物、激素和维生素，这些对于植物的正常生长和发育至关重要[ 3 , 4 ]。这些组织由管状细胞组成，有助于将水和养分从根部运输到叶子（木质部），以及将糖从叶子运输到整个植物（韧皮部）[ 5]。血管组织表现出高度的专业化和异质性。除了其独特的功能外，它们还由不同的细胞类型组成。值得注意的是，这种异质性是由于并非木质部或韧皮部中的所有细胞都是导电元件造成的。韧皮部包括导电筛元件，还包括伴随细胞、参与径向运输和储存的韧皮部薄壁组织以及提供机械支撑的死纤维细胞。在木质部中，传导（气管）元件仅是导管或管胞，与韧皮部类似，存在木质部纤维和具有不同功能的薄壁细胞。木质部中的气管成分在成熟时死亡，而韧皮部中的筛成分是仍然存活的细胞，缺乏某些细胞器，例如细胞核、线粒体和质体[ 5]。血管组织的独特特征和异质性给分子分析带来了重大挑战，特别是在提取和分析组织内的单个细胞时。使用这种功能多样的细胞材料进行批量分子分析会导致不准确的结论。因此，分析维管组织内的基因表达谱需要了解这种植物材料带来的具体挑战。这项工作的主要目的是选择和比较分析植物传导细胞基因表达谱的潜在方法。木质发生和韧皮发生机制的比较分析具有挑战性，但非常重要。对发育中的血管组织进行全面的转录组分析至关重要，因为这些发现可能在通过基因工程改善木材特性方面具有潜在的应用。近年来，专注于开发高通量技术的研究激增，极大地加速了植物分子科学的发展。科学研究的主要目的是了解决定血管组织分化、成熟和功能的难以捉摸和未识别的信号。然而，研究和理解植物中这些复杂的关系提出了重大挑战，可以通过转录组分析来解决。在这篇综述中，我们的目标是在理解和确定在血管组织中进行基因表达分析的最佳解决方案方面取得进展，以增强我们对发育事件的理解在普兰塔。

材料选择与分析
在研究导电组织时，选择合适的测试材料会带来额外的挑战。在分析木质发生或韧皮发生的分化和发育阶段时，由于细胞变异性高以及整个植物器官中气管和筛元件的数量相对较少，详细的转录组分析变得具有挑战性。为了避免错误，使用已知的、解剖学和细胞学控制的材料至关重要。这可以通过组织学分析以及基于自发荧光的组织化学和特异性染色（例如，木质部导管次生细胞壁中的木质素）来实现，这有助于选择适当的器官部分。

观察和研究木质部和韧皮部细胞分化过程中的解剖变化可以通过多种技术来实现，包括光学和荧光显微镜。此外，系列块面电子显微镜可以研究所选植物材料（细胞或组织切片）的表面细节。然而，这些方法都无法研究所观察细胞的分子机制特征。就维管组织而言，由于韧皮部和木质部位于植物器官内的深处，并且被许多其他植物细胞包围，因此这变得特别成问题。

血管组织的选择和分离
基于解剖分析的组织分离
在对维管组织发育进行研究之前，应始终对所研究的植物器官进行精确的解剖分析。解剖学筛选能够确定距根尖或芽分生组织的距离，韧皮部和木质部开始分化并成熟。它还有助于识别形成层细胞形成的区域和该组织的活性，从而导致次生维管组织发育（图1）。此外，这种方法可以识别已知年龄的各个器官的组织发生差异，这可以强烈促进基因表达谱的变化，正如在木发育过程中观察到的那样[ 6]。这种方法有利于选择包含处于特定发育阶段的组织的特定器官部分，以进行旨在检查基因表达的进一步分析。然而，检查基因表达时，获得的结果代表了所选器官片段中存在的所有细胞的集合。如果测试基因的表达不是组织或细胞特异性的，则这种方法可能不足以确定检测到表达的特定组织[ 7]。为了克服这些挑战，理想的解决方案是分离特定组织。在二次生长的情况下，由于其独特的解剖结构，可以手动将木质部与周围组织分离。然而，对于其他组织，例如韧皮部，尤其是初级结构，这种方法并不可行。尽管如此，激光捕获显微切割 (LCM) 等其他技术也非常有用并能成功实施。LCM 技术能够从组织中分离出单个细胞。

图。1
图1
根结构和维管组织发育的解剖筛选（未按比例绘制）

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激光捕获显微切割 (LCM)
激光捕获显微切割 (LCM) 是一种越来越多地用于植物转录组分析的替代方法 [ 8 , 9 ]。LCM 已被证明是韧皮部 [ 10 ] 和维管形成层 [ 11 ] 转录组分析的一种有价值的技术。它已被用于选择拟南芥中的维管组织细胞[ 12 ]、马铃薯中的韧皮部细胞[ 13 ]以及杨树和桉树中的木质部细胞[ 14 ]。LCM 通过使用激光束能够从复杂的生物样本中精确分离单个细胞（图2 ）C）。该方法确保了韧皮部和/或木质部的准确解剖，甚至有利于从复杂组织中收集特定细胞类型，例如分别为韧皮部或木质部传导细胞、筛子或气管元件。这些分离的细胞可进一步用于细胞和组织特异性转录组分析，包括微阵列、RNA-seq 和 RT-qPCR（逆转录酶定量聚合酶链反应）。

图2
图2
该方案说明了在血管组织细胞的基因表达分析中用于获取和分析 mRNA 的方法：微阵列；b批量RNA测序；c激光捕获显微切割（LCM）；d原生质体分离；e核分离；f单细胞RNA测序

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将 LCM 与解剖分析相结合，可以选择与血管组织发育的特定阶段相对应的器官片段（图1），然后可以收集这些片段用于 RNA 分离和随后的分子分析。LCM 之后通常进行 RNA 分离和基因组或转录组分析 [ 15 , 16 ]。尽管 LCM 为分离植物组织提供了可靠的工具，但该技术的材料制备和随后的 RNA 分离可能非常耗时，并且可能会显着影响分离的 RNA 的产量和质量。该技术涉及几个关键步骤，其中样品制备是最关键的步骤之一。有多种方案可用于使用 LCM 分离特定细胞，包括冷冻切片 [17 ] 、石蜡包埋材料[ 18、19 ]和Steedman 蜡包埋材料[ 20、21 ]。使用冷冻切片通常会产生更高质量的 RNA，同时嵌入材料可以保留解剖结构，从而有助于识别复杂生物样本中的单个细胞[ 22,23,24 ]。

在植物中，LCM 技术与高通量基因表达谱相结合是一种强大的工具，广泛用于识别与维管组织相关的各种分子机制 [ 13,14,24,25 ]。然而，它可能会给获得用于转录组分析的高质量 RNA 带来挑战。使用 LCM 制备的材料可以收集并用于进一步分析，包括 RNA 分离和转录组技术，例如微阵列或 RNA 测序。

原生质体分离
原生质体是植物细胞中单个分离的代谢活性部分，没有细胞壁，因此被称为裸细胞。原生质体分离技术已有相当长的历史，可以追溯到 19 世纪末，当时 Hanstein 引入了“原生质体”一词第一次（1880年）和克勒克（Klercker）使用了第一种机械方法来分离原生质体（1892年）。然而，原生质体分离的最大发展发生在 1960 年，当时 Cocking 引入了第一种去除细胞壁的酶法。到目前为止，原生质体已广泛用于包括血管组织在内的转录研究。由于维管组织细胞是植物组织中代表性不足的细胞类型，因此将原生质体分离与 FACS（荧光激活细胞分选）相结合已成为该组织分析的强大工具。FACS 后的原生质体分离可富集目标阳性细胞并消除不需要的阴性细胞，这对于植物组织中韧皮部和木质部细胞的数量至关重要。26 ]。原生质体（图2d）已通过拟南芥根的单细胞RNA测序（图2f）用于韧皮部和木质部细胞转录分析[ 27,28,29,30 ] ，杨树木质部的鉴定和分析[ 31 ]、水稻根尖中的后生木质部[ 32 ]或玉米芽干细胞生态位中的维管细胞[ 33 ]。使用原生质体甚至可以鉴定和分析拟南芥根中特定的韧皮部细胞[ 34]。然而，对于初级木质部细胞，只能分析分化的气管元件，因为成熟元件已死亡。同样，在次生木质部中，只有未分化的木质部薄壁细胞是活的。

另一方面，使用原生质体作为分析基因表达的生物实体可能会令人费解，因为特定的细胞类型对细胞壁消化的抗性，以及原生质体程序对基因表达的影响以及对较小尺寸细胞进行测序的偏向/原生质体。对于韧皮部和未成熟木质部细胞尺寸较大且次生细胞壁较厚的情况，所有这些固有问题甚至更加严重。

血管细胞培养系统
随着血管细胞培养系统的发展，木质部和韧皮部细胞的研究变得更加容易。Fukuda 和 Komamine 于 1980 年建立了一个这样的系统，他们发现了一种通过生长素和细胞分裂素诱导将百日草叶子的叶肉细胞转化为木质部气管成分的方法 [ 35 ]。该系统已被证明是生化和生理学研究的有效模型，并且在研究气管成分方面特别有用，气管成分可占几乎同质木质部气管成分的 80% [ 36]。百日草系统已被用来研究许多基因表达谱，特别是与木质部形成相关的基因，包括伴随原生质体降解和次生细胞壁形成的程序性细胞死亡（PCD）[ 37,38,39 ]。此外，百日草系统已用于重点研究涉及气管元件分化调节的基因[ 40 ]、图案化的次生细胞壁沉积[ 41 ]、木质素生物合成以及涉及PCD过程的基因，例如编码蛋白酶、脂肪酶和核酸酶 [ 38]。使用百日草系统还鉴定了一组由 HD-ZIP III 同源盒基因编码的转录因子，这些转录因子对于血管发育至关重要 [ 42 , 43 ]。此外，该系统还揭示了木质部分化过程中木质素的信号传导功能[ 44 ]，以及CLE肽在血管细胞分化中的功能[ 45 , 46 ]。在气管元件发育过程中，第一个被识别的参与 PCD 的基因是ZEN1 ( ZINNIA ENDONUCLEASE 1 )，它是一种 S1 型核酸酶，直接在核 DNA 降解中发挥作用 [ 47 ]，并且可能位于液泡中 [48 ]。除了ZEN1之外，百日草细胞培养物中还鉴定出了其他几个基因，包括编码肉桂醇脱氢酶和过氧化物酶的基因 [ 49 , 50 ]、β-微管蛋白 [ 51 ] 和气管元件分化标记 (TED 2-4) [ 52，53，54 ]。​ 百日草细胞培养不仅作为与血管组织发育相关的基因的信息来源，而且还有助于确定生长素在细胞分化为气管成分中的作用[ 55 ]，并表明其他植物激素的存在和可能的功能。例如油菜素类固醇 [ 56]、赤霉酸和乙烯[ 57 ]。

除了百日草细胞培养物之外，拟南芥细胞也可以被诱导分化为气管元件，尽管效率低得多（高达30%）[ 58 ]。拟南芥细胞转分化为气管元件的实验表明，编码一些微管相关蛋白（MAP70）的基因参与木质部发育过程中的次生细胞壁合成[ 59 ]。对拟南芥细胞培养物的研究还发现了VND6、VND7和SND1基因作为后木质部和纤维细胞分化的主要调节因子 [ 60 , 61 ]。

拟南芥细胞转分化创建了另一个用于研究木质部发育的强大系统，称为 VISUAL（使用拟南芥叶的血管细胞诱导培养系统），它揭示了筛元样细胞的连续分化。在存在比激肽、生长素、细胞分裂素和阿菲迪霉素的情况下，该培养系统中的细胞也可以分化为木质部和韧皮部[ 62 ]。使用VISUAL系统，已经鉴定了一些参与木质部和韧皮部发育的基因，例如BRI1-EMS-SUPRESSOR1（BES1）[ 63 ]和BZR1 ，它是与BES1最接近的同源基因在促进血管干细胞分化为木质部和韧皮部方面具有类似的功能[ 64 ]。

此外，维管组织中具有异常表型的拟南芥突变体是研究木质部和韧皮部发育相关基因的有力工具。有大量拟南芥突变株系有助于鉴定与维管组织发育有关的许多基因，例如HD-ZIP III和KANADI基因 [ 42 , 65 ] 或涉及的APL ( ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT ) 基因在木质部-韧皮部转换中[ 66 ]。使用拟南芥突变体鉴定的其他基因包括VND6和VND7（血管相关 NAC-DOMAIN6和-DOMAIN7）），调节木质部导管的分化[ 61 ]，IRX（IRREGULAR XYLEM）基因参与纤维素合成[ 67 ]，SMXL3-5（SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE3-5），它们是韧皮部形成的关键调节因子[ 68] ]、BRX ( BREVIS RADIX ) 具有发育原韧皮部的活性 [ 69 ]、OPS ( OCTOPUS ) 调节韧皮部分化 [ 70 ] 、CLE25/26/45 ( CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION ) 编码原韧皮部分化抑制因子的基因 [71、72 ] 。 _

血管组织分析的高通量技术
在过去的二十年中，高通量基因表达谱已成为分子生物学中一种主要而强大的方法。与传统的基因表达方法（例如 Northern 印迹分析或核糖核酸酶保护测定）不同，高通量技术能够以显着更高的灵敏度进行大规模基因表达研究。此外，这些研究生成的数据集存放在存储库中，预计将作为科学界多年的核心资源。

大量 RNA 的 RNA 测序 (RNA-seq) 是分析混合细胞群或特定组织转录组的首选方法。该方法提供了所有测试细胞或组织的一般知识和平均基因表达模式，从而提供了分析材料中基因表达的广泛概述。然而，执行总 RNA 测序可能会产生包含多种细胞类型的组织样本的平均基因表达值，可能会忽略细胞之间的重要差异。对于木质部和韧皮部及其细胞异质性，批量 RNA-seq 可能不足以获取有关组织分化和发育机制的信息。此外，血管传导细胞（筛子和气管元件）的数量通常少于实质细胞，并且这些平均基因表达水平可能无法准确代表韧皮部和木质部传导细胞转录组学。这就是为什么应该应用前面描述的方法之一（参见“激光捕获显微切割（LCM） ”部分）。在相同条件下对大量基因进行转录组分析，再加上有关基因表达谱的知识，对于了解调节所有生物体（包括植物及其维管组织）中特定器官或组织发育的分子途径至关重要。基因表达的综合表征是揭示复杂多细胞生物体内特定区域、组织和细胞基因表达谱的有力工具。鉴于我们目前在这一至关重要的领域的知识不足，因此有强烈的动机使用高通量技术进行深入研究，以研究木质部和韧皮部等特殊组织及其传导元件中的基因表达。

微阵列
第一个广泛使用的、可在短时间内同时测定数百至数千个基因转录水平的高通量技术是微阵列分析（图2a）[ 73 ]。该技术与荧光激活细胞分选相结合，已用于根据细胞和组织的特征表达谱来识别和表征细胞和组织，例如拟南芥根细胞，包括所有类型的木质部和韧皮部[ 26 ]。该技术的核心原理依赖于 DNA 杂交，遵循沃森-克里克规则，使用具有许多微点的阵列板，其中固定有短寡核苷酸探针[ 74]]。在第一步中，对分离的 mRNA 进行逆转录，然后使用不同的染料对对照和实验（处理）样品进行荧光标记。微阵列分析是一种强大且系统的方法，经常用于研究植物中的基因表达，特别是在维管组织（例如木质部）的研究中[ 75,76,77 ]。然而，由于多种限制，微阵列技术正日益被其他高通量基因表达方法所取代。这主要是由于微阵列在分析未知基因方面的局限性，以及检测可变剪接形成的多个转录本的困难[ 78 ]。

微阵列技术能够鉴定拟南芥细胞培养物中参与次生细胞壁合成的多个基因。这些基因由 SND1 和 VND6 基因调节子诱导[ 79 ]，属于 MYB 转录因子家族（MYB46、MYB83 和 MYB103），表明它们可能参与木质部导管和纤维的次生细胞壁形成过程。此外，SND1和VND6上调了参与细胞骨架组装的多个基因，包括编码肌球蛋白、微管蛋白、驱动蛋白的基因和囊泡转运相关基因（Rab GTPases）[ 79 ]。这些发现表明细胞骨架重建和囊泡运输参与木质部血管和纤维的分化[ 79]。此外，微阵列实验还鉴定了一些与 VND6 诱导的细胞原生质体降解相关的木质部特异性基因。这些基因包括半胱氨酸蛋白酶（XCP1、XCP2、XSP1）、核酸酶（RNS3）、元半胱天冬酶（ATMC9）和脂肪酶（DSEL）[ 79 ]。

微阵列分析还揭示了拟南芥木源细胞培养物中参与次生细胞壁合成和细胞死亡的上调基因，例如IRREGULAR XYLEM 3 ( IRX3 )、IRX6、IRX8、XCP1和XCP2 [ 80 ]。对细胞系统中基因表达的分析还鉴定了几种 NAC 结构域转录因子，它们充当气管元件分化的调节因子[ 61 ]。其他木质部特异性基因，包括XYLEM 半胱氨酸蛋白酶 1 ( XCP1 ) 和LOB 域包含蛋白 15 (LBD15 ) 也通过微阵列分析进行了鉴定 [ 61 , 81 ]。微阵列分析表明，在毛果杨中，几个与拟南芥基因同源的NAC基因（ VND、NST和SMB）被发现是木质部发育中的功能转录因子。许多 NAC 域蛋白编码基因被认为可以调节杨树的木材形成，这些基因可能在杨树和拟南芥之间具有保守的功能 [ 82]。此外，微阵列分析还鉴定了参与细胞死亡、细胞壁合成、纤维素合酶、木质化、结构蛋白、细胞骨架组织、信号转导和可能参与木质部发育的转录因子的基因[ 82 ]。此外，微阵列分析表明，生长素通过促进气管元件分化从第一阶段到第二阶段的转变，在早期木质部分化中发挥重要作用[ 55 ]。微阵列分析也有助于探索韧皮部的发育。在微阵列中发现BES1和BZR1作为参与韧皮部分化调节的基因 [ 64]。微阵列分析还揭示了次生细胞壁合成和韧皮部发育之间有趣的相互作用[ 83 ]。它为特别长的亚麻茎中韧皮部细胞发育的分子基础提供了有价值的见解，不仅提供了有关韧皮部发育的重要信息，而且还为未来作物改良提供了巨大潜力[ 84 ]。微阵列还获得了有关韧皮部形成的转录因子的知识，例如 PEAR（韧皮部富集的 Dof 转录因子），它调节原形成层细胞分裂成韧皮部前体的数量 [ 85 ]。

下一代测序（NGS）
目前可用于获得有关血管组织细胞基因表达详细信息的最先进的分子方法之一是下一代测序（NGS），特别是与激光捕获显微切割（LCM）结合使用时（图2b，c）。NGS 通常被称为大规模并行测序。与第一代自动桑格测序技术相比，各种 NGS 技术能够在显着更短的时间内确定整个基因组、目标 DNA 区域或 RNA 片段中的核苷酸序列 [ 86 ]。NGS 可以在一天内完成全基因组测序，而使用桑格技术对人类基因组进行测序需要十年[ 87]。第一个通过 RNA-seq 表征的植物转录组是水稻 [ 88 , 89 ]、葡萄树 [ 90 ] 和拟南芥雄性性母细胞 [ 91 ]。此后，NGS 因其比微阵列技术更强大、灵敏度更高、基因组覆盖范围更广而被广泛应用于基因表达分析[ 92 ]。此外，NGS 能够检查非编码 RNA 转录，这对于细胞代谢和功能调节至关重要。例如，已使用 NGS 研究了韧皮部汁液中鉴定的长非编码 RNA，因为它们可能在韧皮部功能中发挥作用 [ 93]。NGS 已成为分析维管组织的重要方法，可以鉴定与木质部和韧皮部发育、细胞壁生物合成、细胞分裂和蛋白质合成/周转有关的多个基因[ 12 ]。值得注意的是，NGS 帮助鉴定了含有 NAC 结构域的转录因子和 MYB 转录因子作为木质部次生细胞壁合成的关键调节因子 [ 94 ]。此外，REVOLUTA ( REV )、PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM ( PXE )、纤维素合酶 IRREGULAR XYLEM ( IRX ) 和CLAVATA3/ESR 相关( CLE )等基因）已通过 NGS 分析与血管组织发育相关[ 12 ]。研究发现，发育中的血管组织中参与细胞分裂的基因表达显着上调[ 94 ]。除了基因表达分析之外，RNA-seq 也是研究选择性剪接的重要工具。例如，一项对毛果杨木质部转录本的研究表明，木质部中大约36%的表达基因可以进行选择性剪接，包括与细胞壁合成相关的基因[ 95 ]。

随着 RNA-seq 的进步，它已与 LCM 结合起来，以实现单细胞水平的基因表达研究。RNA-seq-LCM 组合技术已用于表征早期植物发育过程中黄瓜 ( Cucumis sativus ) 果实中不同类型韧皮部的转录组特征 [ 9​​6 , 97 ]。这项研究在韧皮部研究中发挥了重要作用，导致鉴定出一组重要的韧皮部特异性转录本，其中包括 31 个与韧皮部特异性蛋白（P 蛋白）相关的基因 [ 96 , 97]。此外，RNA-seq 与 LCM 结合可以研究植物对各种胁迫的反应，例如紫外线辐射、水杨酸和其他对血管有重大影响的化合物（例如抗霉素、3AT 或甲基紫精）。组织[ 12 ]。

使用 NGS 技术的 RNA 测序需要从单细胞（在 LCM 程序的情况下）、特定组织切片或整个植物器官中分离总 RNA。由于总 RNA-seq 为 RNA 分离中使用的细胞提供了平均基因表达谱，因此获得高质量的 RNA 以确保可靠的测序结果至关重要。RNA 的质量通过 RNA 完整性数 (RIN) 进行评估，这对于获得高质量的 RNA-seq 结果至关重要 [ 98 , 99]。然而，获得高质量的 RNA 可能具有挑战性，特别是在使用 LCM 时，这限制了用于血管组织分析的批量 RNA-seq 的信息量。这种限制可能会导致转录组分析出现错误结果，特别是在研究韧皮部和木质部细胞时，因为与其他植物细胞相比，韧皮部和木质部细胞具有独特的 RNA 特征。

单细胞RNA测序
单细胞水平转录组分析的高通量方法的发展，称为单细胞RNA-seq (scRNA-seq)（图2f），彻底改变了我们对各种生物过程中细胞类型和状态的理解。在植物细胞图谱联盟提出的技术框架内，单细胞测序在全面了解植物细胞结构和功能方面发挥着关键作用[ 100 ]。在不同的方法中，基于液滴的解决方案已经受到欢迎。这些方法基于以下原理进行操作：微流体系统将单细胞悬浮液中的单个细胞封装成纳升油包水液滴（图2 ）d、e)，每个都包含一个带有条形码标记的珠子。这确保了细胞及其转录本都接收到唯一的标识符，从而能够将转录本明确分配给各个细胞。由于工作流程涉及oligo(dT) 引发，因此仅捕获聚腺苷酸化转录物并将其转化为双链DNA 文库。随后，使用 NGS 平台对转录组数据进行测序，并将信息分配给各个细胞。通过基于基因表达谱的相似性对细胞进行聚类，可以使用已知的标记基因来注释细胞类型。此外，细胞可以沿着代表不同细胞状态的推断轨迹排列，从而能够跟踪发育和分化过程。详细的实验和计算机模拟scRNA - seq的工作流程已在[ 101、102、103、104 ]中进行了回顾。尽管基于液滴的方法提供了前所未有的通量，但某些样品类型可能与当前平台不兼容。这特别是指大细胞，它们无法通过微流体通道，因此不会被封装。因此，人们探索了涉及在多孔板中沉积单细胞的替代方法，牺牲通量以提高不同细胞类型的捕获效率[ 104]。尽管是一项突破性技术，但只有满足特定条件（包括样本质量和参考数据的可用性），scRNA-seq 的全部潜力才能发挥出来。最近的出版物概述并广泛讨论了植物 scRNA-seq 研究的范式，涵盖实验规划和数据分析注意事项[ 101、105、106 ]。附加文件1中提供了所选主题的摘要。

自 2019年发表第一个拟南芥根部高通量单细胞转录组数据以来 [27,28,29,30,107,108 ] ，基于液滴的方法在植物研究中得到了普及，使得关键过程的研究成为可能例如信号传导[ 109 , 110 ]、发育[ 111 , 112 ]以及对非生物胁迫的细胞类型特异性反应[ 113 , 114 ]。几项研究特别关注血管组织（表1）。例如，scRNA-seq用于研究木质部细胞终末分化的分子机制，特别是VND7对拟南芥根伸长区单个细胞发育轨迹的影响。研究表明，仅 VND7 就足以启动木质部细胞分化，并确定了参与此转换的靶基因。发现皮质、毛母细胞和内皮细胞更容易转化为成熟的木质部细胞。此外，VND7、MYB46或MYB83的过度表达（编码已知参与终末分化的转录因子）与血管发育的不同过程相关[ 108]]。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 的强大功能已被用来研究拟南芥根顶端分生组织中的细胞分裂素信号传导。精确控制活性细胞分裂素从木质部到原形成层和韧皮部细胞的流动至关重要，因为这种植物激素水平升高会破坏血管分化。通过利用细胞类型特异性转录组数据，在原形成层细胞中发现细胞分裂素氧化酶 3 ( CKX3 ) 的表达增加，这表明根组织中细胞分裂素水平调节的机制[ 110 ]。同样，scRNA-seq 结合实时成像用于检查拟南芥根韧皮部发育在单细胞分辨率下。该研究描述了从干细胞到去核的 19 个发育阶段，并确定了参与整个过程的关键基因。这些基因包括PHLOEM 早期 DNA 结合单指( PEAR ) 和APL，它们与流行的 PLETHORA 调节因子一起作用，协调韧皮部成熟 [ 115]]。此外，scRNA-seq 促进了拟南芥根中韧皮部分化的综合图谱的生成，包括原韧皮部筛元件谱系、中柱鞘细胞、后生韧皮部筛元件和伴细胞。这种方法揭示了以前代表性不足的细胞类型，并显着增进了我们对韧皮部分化过程的理解[ 116 ]。

表 1 植物维管组织选定的 scRNA-seq 研究总结
全尺寸桌子
其他 scRNA-seq 发现主要集中在拟南芥叶 [ 117 ] 和子叶 [ 118 ] 中的维管组织。就叶子而言，构建了包含维管组织内所有细胞类型的图谱，包括研究较少的韧皮部薄壁细胞。该图谱提供了对细胞谱系关系的见解，并表明韧皮部薄壁细胞除了在运输糖和氨基酸方面的作用外，还参与激素和芥子油苷的生物合成[ 117 ]。子叶的研究揭示了脉管系统的早期发育轨迹，并确定了循环自由因子 5 (CDF5) 和 GA 抑制因子 (RGA) 作为参与调节这一过程的潜在转录因子 [ 118 ]。

近年来，已有一些关于木本植物茎中维管组织的报道，主要是杨树以及其他被子植物物种。例如，构建了杂交杨木质部分化图谱，包括导管细胞、纤维细胞、射线薄壁组织细胞和木质部前体细胞。这有助于识别候选转录因子，包括 PagSND2、PagMYB42 和 PagSND1，这些因子参与控制木质部细胞的命运 [ 31]。此外，高度木质化的杨树茎的 scRNA-seq 分析不仅证实了转录组景观以及木质部和韧皮部发育的现有知识，而且揭示了对血管分化过程中植物激素信号传导的新见解。此外，这种方法证明了剖析旁系同源物功能冗余的能力[ 119]。所有上述研究都是使用原生质体作为样本类型进行的。通过应用单核 RNA-seq (snRNA-seq) 分析杨树芽尖，可以进一步阐明木本植物维管系统的成熟。通过比较杨树和拟南芥中初级维管组织的转录景观，对参与维管发育的调控基因进行了表征。这项分析揭示了保守且独特的机制，为进一步研究一年生和多年生植物维管组织分化铺平了道路。scRNA-seq 数据还有助于选择用于详细功能研究的基因，从而阐明LAX2在促进杨树木质部分化中的作用[ 120]。最近一项结合 scRNA-seq 和 LCM 的研究提供了对进化背景下木质部发育的全面了解，从木兰科植物到基础真双子叶植物再到核心真双子叶植物（木兰、百合、巨桉、毛果杨）。这项研究提供了射线谱系高度保守性和梭形谱系更大进化变异性的证据，射线薄壁细胞和轴向木质部元素遵循不同的发育路径[ 121]。因此，所引用的例子毫无疑问表明 scRNA-seq 是一种有前途的技术，可以为解决有关血管组织的结构、发育和功能关键方面的长期存在的问题做出重大贡献。持续的技术进步使我们预计 scRNA-seq 将很快得到同时探索多种模式（例如染色质可及性或蛋白质组学）的方法的有效补充[ 122]。此外，空间转录组学揭示了解剖学背景下的单细胞基因表达谱，将进一步扩大研究稀有和隐藏细胞类型的可能性。例如，最近，高分辨率显微镜与空间转录组的结合发现韧皮部和木质部细胞是由两个独立的原形成层样细胞池产生的，这些细胞在杨树茎的次生维管组织中显示出不同的定位[123 ]。

选定关键基因的转录组验证
在所有类型的转录组分析中鉴定出的基因需要使用分子方法进行进一步研究。RT-qPCR 是评估所选基因表达谱的首选方法。通常，制备至少三个生物复制品以确认差异转录物表达，如特定发育阶段的特定细胞、组织或植物器官的惯例。该分析的一个重要方面是确定至少两个或三个在测试组织中稳定表达的参考基因，例如GAPDH或ETIF5A [ 124 ]、18S rRNA、肌动蛋白、β-微管蛋白、延伸因子 1α或泛素[ 125 , 126 ]。RT-qPCR 是确认血管细胞培养物中细胞分化的一种有价值的技术，因为它可以检查标记基因表达水平，例如韧皮部细胞的APL或SEOR1和木质部细胞的GSK3S [ 62 ]。基于此，可以确定所选基因是否通过其过表达作为细胞培养物中木质部分化调节因子的下游靶标参与木质部或韧皮部发育[ 79 ]。

反向遗传学方法[ 61 ]是另一种针对选定基因的验证方法，特别是对于具有T-DNA突变体文库的物种，例如拟南芥[ 127 ]。拟南芥拥有大量保存在 NASC（诺丁汉拟南芥库存中心）的 T-DNA 突变系，这些突变系最初于 2003 年使用诱变方法获得[ 128 ]。几种拟南芥 T-DNA 突变体已用于维管组织研究，包括cs7 （ CALLOSE SYNTHASE 7基因突变）[ 129 ]、clerk-5 （ CLE 抗性受体激酶基因突变）[130 ]、aap2 （氨基酸渗透 2基因突变）[ 131 ]、apl （ ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT基因突变）[ 66 ]、ops-2 （章鱼基因突变）[ 70 ]、涉及的几个突变体木质部次生细胞壁合成 [ 132 ]、vnd7 （血管相关 NAC DOMAIN7基因突变）[ 52 ] 和cep1 （木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶突变）[ 133]。使用拟南芥 T-DNA 突变体已确定APL是韧皮部发育的关键基因 [ 66 ]，TDIF-TDR-WOX4信号通路对于维持次生生长期间的维管结构至关重要 [ 134 ]，以及TMO5/LHW转录因子作为植物胚胎中维管发育的重要调节因子[ 135 ]。

血管组织中的基因/转录本定位和可视化
原位杂交（ISH）
显微技术的重大进步提供了宝贵的工具，可以通过定位和可视化转录本的单个副本来全面了解复杂的血管组织发育过程。原位杂交 (ISH) 是研究 mRNA 定位的强大方法，与生物信息学工具结合使用，可以增强对基因表达机制的理解 [ 136 , 137 ]。该技术利用直接与互补目标 mRNA 结合的标记分子探针，从而能够在细胞和亚细胞水平观察转录本定位[ 138]]。最初，ISH 采用放射性同位素标记的探针，因为它们具有高灵敏度。然而，由于放射性暴露的高风险以及与放射性废物处理相关的挑战，荧光标记和/或半抗原标记的探针已取代它们[ 139 ]。荧光原位杂交 (FISH) 技术更安全，但也具有挑战性，特别是在具有高自发荧光的植物组织中，特别是在木质部中。对于可能的探针结合位点较少的短转录本以及细胞中丰度非常低的转录本来说，这一挑战更为明显[ 140]。此外，木质素、单宁或叶绿素等天然分子的存在也会导致高水平的背景自发荧光。此外，通过将植物样品固定在醛基固定剂中可以诱导或增强自发荧光[ 141 ]。为了实现高度灵敏的空间转录组学分析，已经引入了几种方法（图3）。

图3
图3
基于直接荧光原位杂交 (FISH) 杂交现象可视化 mRNA 定位的方法；b Stellaris™ FISH；c酪酰胺信号放大-FISH；d RNAscope - ISH；碱性磷酸酶​

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ISH/FISH 技术修改
Stellaris™ FISH 技术是标准 FISH 方法的改进，可增强荧光信号并最大程度地减少由于非特异性探针结合或蛋白质与 RNA 相互作用堵塞探针结合位点而产生的假阴性或假阳性信号 [ 142 ] 。Stellaris FISH 技术采用多个单标记探针，这些探针与目标 RNA 转录本杂交，共同发射比单个探针明显更高的荧光信号（图3b）。除了 mRNA 检测之外，该技术还可以对单个 RNA 分子进行定量，因为通过传统荧光显微镜将每个局部转录物观察为衍射极限点 [ 142 ]。

酪酰胺信号放大( TSA ) 也称为催化报告沉积 (CARD) 方法，是一种超灵敏技术，利用酶促增强来增加信号强度并检测低丰度 mRNA 靶标 [ 143 , 144 ]。TSA 利用辣根过氧化物酶 (HRP) 的催化活性，在过氧化氢 (H 2 O 2 ) 存在的情况下，将荧光标记的酪酰胺转化为高反应性酪酰胺自由基，该自由基可快速与酶位点上及其附近的酪氨酸残基结合（图3c）[ 145]。FISH 与 TSA 结合使用标记有半抗原（通常是地高辛，但也有生物素、荧光素、二硝基苯酚 (DNP)）的探针，可被抗体识别。在直接方法中，抗半抗原抗体用 HRP 标记，但更常见的是，间接方法是使用，涉及使用两种类型的抗体（抗半抗原和 HRP 标记）。与传统荧光探针相比，TSA 检测可提供高达 100 倍的信号增强，这在强烈的自发荧光使得植物组织中特别有用。信号可视化具有挑战性[ 146 ]。

另一种超灵敏方法是RNAscope 原位杂交，能够通过信号放大和背景噪声抑制来检测和定位目标 mRNA [ 137 , 147 , 148 ]]。与标准 RNA ISH 的主要区别在于所使用的分子探针类型。RNAscope 使用一对 Z 形探针，每个探针由三个片段组成：下部区域，与目标序列互补；下部区域，与目标序列互补。上部区域，形成前置放大器的结合位点；以及连接它们的中间序列。前置放大器与每个 ZZ 对创建的结合位点结合，从而允许随后连接多个放大器。最后，标记探针粘附在所有放大器上的结合位点上，从而实现目标 mRNA 的可视化[ 137 ]。RNAscope 与两种荧光标记探针兼容（图3d）和各种半抗原标记的探针，从而促进显色和荧光染料的后续使用[ 147 ]。

ISH-AP是标准原位杂交技术的一种广泛使用的改进，它利用碱性磷酸酶 (AP) 催化活性克服了自发荧光问题 [ 149 , 150 ]。在该反应中，与 TSA 技术类似，使用半抗原标记的探针，并通过与碱性磷酸酶缀合的抗半抗原抗体以高亲和力进行检测（图3e）。或者，也可以使用未缀合的抗半抗原抗体和缀合的第二抗体。AP 活性通过在硝基蓝氯化四​​唑存在下，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯 (BCIP) 水解为 5-溴-4-氯-3-吲哚，形成紫色沉淀来定位（NBT）[ 151]。AP 活性也可用于 RNAscope 测定，其中使用 AP 标记探针代替荧光标记探针 [ 147 , 152 ]。

结论
转录组分析在发现新的基因功能和转录因子、揭示基因表达的调控机制以及识别影响细胞和组织功能的因素方面发挥着至关重要的作用。虽然通过转录组分析获得了有关木质部发育的重要知识[ 153 ]，但我们对韧皮部细胞发育的理解仍然有限。众所周知，MYB 转录因子 APL 是筛元件分化的关键调节因子[ 66 ]。一些涉及韧皮部和木质部发育的调节因素已被确定[ 3]，但在韧皮部发育过程中阻止细胞降解的机制仍然未知。与韧皮发生不同，木质发生已被广泛研究，例如在P. trichocarpa的根中，木质部发育的所有阶段以及不同类型根（先锋根和须根）之间的分化都已被表征[ 154 ]。

虽然上述转录组分析方法为维管组织及其发育提供了有价值的见解，但木质部和韧皮部发育的某些方面仍然难以使用传统的基于组织的方法进行研究。从单细胞获取转录组信息可能有助于解决这些挑战，尽管它也存在一系列困难，例如使用 LCM 或通过称为单细胞 RNA 测序的最新高通量方法。单细胞 RNA-seq 代表了基因表达高通量分析的重大进步，在总 RNA 测序出现仅十年后就出现了。当第一个单细胞RNA测序方案于2009年发布时[ 155]，它彻底改变了涉及整个植物器官内低丰度细胞（例如木质部和韧皮部细胞）的研究。与批量 RNA-seq 相比，scRNA-seq 具有许多优势，包括识别稀有细胞群、检测单个细胞中的突变以及确定池内细胞异质性的能力 [ 156 ]。最初，scRNA-seq 主要用于人类和动物研究，花了几年时间将该技术应用于植物 [ 30 , 157 ]。然而，在很短的时间内，这项技术就能够发现以前未知的植物生物学元素，例如调节侧根发育的基因[ 158 ]和响应磷酸盐水平的根毛密度调节剂[ 111 ]]。因此，scRNA-seq 在充分理解植物基因的调控方面具有广阔的前景。