1 . 介绍
犬 麻疹病毒（CDV，以前称为犬瘟热病毒）是副粘病毒科麻疹属一种大包膜单负链RNA病毒。该病毒广泛分布于除南极洲以外的各大洲。它在陆地食肉动物中具有广泛的宿主范围，还可以感染里海海豹和贝加尔海豹以及多种猕猴[1]。

CDV导致家犬犬瘟热，这是一种可能危及生命的严重发热性全身性疾病，影响多个器官系统，眼、鼻分泌物和呼吸道症状是最明显的临床特征[2]。该病毒持续存在于野生动物宿主中[1] ，并且仍然在许多国家[3]的未接种疫苗的狗中引起频繁而严重的疾病。尽管这种疾病在疫苗覆盖率高的国家被认为不常见，但偶尔有报告表明，接种疫苗的狗在疑似现场感染后出现了犬瘟热迹象[4]。

改良活疫苗（MLV）用于预防狗的犬瘟热，但由于缺乏家犬以外的物种的安全性数据以及它们可能引起疾病的风险，因此通常不建议将这些疫苗用于其他物种[2]，[5] . 此外，随着近亲繁殖和纯种狗基因库的减少[6]，这已经导致某些品种的MHC纯合性增加[7]，免疫病理疾病和免疫学变化的风险可能会增加，从而导致疫苗接种不良家犬的影响和疫苗诱发的疾病。在人类其他疫苗的疫苗安全性方面也强调了这一风险 [8] .

人们对家犬中与疫苗相关的犬瘟热的风险知之甚少，但文献中偶尔有描述[9]、[10]、[11]、[12] 。由于其复杂性以及犬种之间有些不可预测的免疫学差异，尚未了解或彻底研究可能导致犬患这种疾病的所有可能的潜在遗传或病理生理学因素。术语“疫苗后犬瘟热脑炎”(PVE) 用于描述一种非特异性神经系统疾病，有时见于幼犬在接种 MLV 疫苗后 1-3 周[13]。免疫刺激与CDV疫苗接种同时发生的其他犬病毒引起的 PVE 被认为是 PVE 的原因[13]，以及疫苗的残留毒力、由于免疫力改变而导致宿主易感性增加以及疫苗激活的潜伏感染[14] ]。由于疫苗接种与观察到的症状的时间关系以及自然感染的可能性较低，病例通常被认为与疫苗相关[9]、 [10]、 [11]、 [12]。病原体的遗传特征很少进行，因此常常缺乏疫苗诱发疾病的明确证据。由于接种疫苗的狗可能会受到来自野生动物宿主的感染，并继续发展为自然CDV 感染 [4]、[15]，因此区分尽管接种疫苗仍产生的自然感染与真正的疫苗诱发疾病非常重要，因为可能这些选项之间的潜在问题（例如疫苗、疫苗接种、狗的免疫状态）有所不同。迄今为止，尚未有文献报道通过逆转录PCR证实疫苗引起的家犬犬瘟热病原菌株(RT-PCR) 和测序以匹配疫苗株。

大多数 PVE 病例的特点是 1-5 天的急性至亚急性临床病程[13]，但症状可能需要两周以上才能出现[12]。急性病程可能具有让人想起狂犬病的狂暴形式的临床症状，例如攻击性行为和试图攻击[11]、[12]、[13] 。大多数描述的病例包括丘脑或脑干灰质中明显的神经病理学发现，包括软化、核内包涵体和非化脓性脑炎[11]，[12]。轴突变性还可以看到白质的轻度至中度海绵状空泡化[12]。由于白质 相对较少，PVE 有时被描述为不同于自然感染[13]、 [16]。然而，类似的白质病变确实发生在非典型形式的犬瘟热中，例如老年犬脑炎，Koutinas 等人。[17]还报道了自然感染，其中灰质病变比白质病变更突出。PVE很少见其他器官的病变[11]， [12]，这也与大多数自然感染不同[12]。淋巴组织在自然感染中经常受到影响，包括水肿、淋巴耗竭和坏死[4]、 [16]、 [18]、 [19]。即使在自然感染中，肠道病变也不常见，通常包括轻度卡他性肠炎和淋巴样丧失[4]、 [16]、 [18]、 [19]。

在我们的报告中，我们展示了两窝不同品种的狗，它们具有不同的体征和病变，这些症状和病变是在接种广泛使用的商业CDV MLV 后发生的。一些病变以前没有被描述为与犬瘟热有关。我们的目的是通过比较受影响组织中的病毒遗传物质与所使用的病毒疫苗株来研究疫苗在这些病例中的作用。

2 . 材料和方法
A 窝由 2016 年在芬兰出生的 10 只德国西班牙猎犬幼犬组成。所有幼犬发育正常，临床健康，直到 11-12 周龄第一次接种疫苗为止（ 表 1 ）。七只小狗（男女皆宜）接种了来自制造商 B 的同一批（第 1 批）疫苗 B (VB1)，这是芬兰广泛使用的两种商业多价疫苗之一，含有改良活犬 麻疹病毒（Onderstepoort 株）、犬腺 病毒（2型，曼哈顿LVP3株）、犬细小病毒（154株）、犬副流感病毒（康奈尔菌株）。一只小狗接种了制造商 A 的类似疫苗（疫苗 A，针对相同的疾病，使用相同的 Onderstepoort 衍生 CDV 株）。两只小狗由于其他小狗出现的症状而没有接种疫苗。

B 窝由 2019 年在芬兰出生的 5 只猎狐犬幼犬（雌雄）组成。所有幼犬均发育正常，在出现体征之前总体上都很健康。所有幼犬均根据不同的时间表和不同批次的疫苗 B 进行了疫苗接种（ 表 1）。

A窝受影响的小狗于2016年接受了临床检查，B窝受影响的小狗于2020年在疫苗接种后接受了临床和神经学检查。在神经学检查期间采集了小狗 B1 的脑脊液( CSF) 样本，并将其送往私人实验室公司 (Laboklin GMBH & CO.KG) 进行分析。根据临床表现对动物进行治疗，除了一只以外，所有动物都因预后不良而死亡或被安乐死，并被送去尸检。从临床医生、饲养员和主人那里收集了受影响小狗的临床病史和窝内所有小狗的疫苗接种史。

进行了完整的尸检，并从所有主要器官（包括大脑、骨髓和淋巴结）中采集了样本进行组织学评估。将组织固定在中性缓冲的 10% 福尔马林中，进行常规处理，包埋在石蜡中，切成 4 µm 切片，并用苏木精和伊红(HE) 染色。德国西班牙猎犬的淋巴结切片还用革兰氏染色法进行细菌染色、高碘酸希夫 (PAS) 染色法进行碳水化合物染色、Ziehl-Neelsen (ZN) 染色法进行抗酸细菌染色、Gomori 乌洛托品银 (GMS) 染色法进行真菌染色和 Warthin-Starry (WS)螺旋体染色。

在所有病例中，对选定的受影响组织进行CDV免疫组织化学染色。此外，对 A窝样本的肠道派尔氏集结、选定的淋巴结和肺进行了犬细小病毒的免疫组织化学染色，并对A 窝样本的肝脏[20] 进行了犬腺病毒 2 型的免疫组织化学染色。这些不是对 B 窝进行的，因为没有发现由这些病毒引起的损伤。将福尔马林固定石蜡包埋的组织切成 4 µm 切片，在 UltraClear（JT Baker，荷兰）中脱蜡，并在分级乙醇系列中再水化。新奥特​检测时，使用热诱导抗原修复，将切片用 pH 6 柠檬酸盐缓冲液在高压锅中于95 °C 预处理 20 分钟。对于犬细小病毒检测，切片用蛋白酶 K 溶液在 37°C 下预处理 10 分钟。将切片与小鼠单克隆抗犬瘟热病毒抗体（Bio-Rad Labs，CA，USA）、抗犬/猫细小病毒抗体（Bio-Rad Labs，CA，USA）和抗腺病毒抗体一起孵育(Chemicon, CA, USA)稀释60 分钟室温下分别为 1:20、1:50 和 1:100。根据制造商的说明，使用 UltraVision ONE HRP 聚合物和 AEC 色原检测系统套件（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）对所有切片进行免疫组织化学染色。将切片用苏木精复染并用水性封固剂封固。在标准光学显微镜下评估载玻片。

通过 RT-PCR 分析以下样本中CDV的存在：福尔马林固定和石蜡包埋的德国西班牙猎犬（A 窝）的肠道派尔氏集结和受影响的淋巴结；狐狸梗（B 窝）的大脑、脊髓和肺的新鲜组织样本以及结膜拭子样本；以及用于接种德国西班牙猎犬的疫苗批次（VB1）。分别使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 或 AllPrep DNA/RNA FFPE 试剂盒 (Qiagen Inc, CA, USA) 从新鲜组织或福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取用于 RT-PCR 的 RNA模板。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取疫苗 B 中的 RNA。从来自窝 A 和 B 组织样本以及未使用剂量的疫苗 B 的 RNA 中，CDV 的 429 bp 片段磷蛋白（P）基因[21]被扩增。此外，从 A 窝样本中扩增出CDV 融合蛋白 (F) 基因[22]的 372 bp 片段。使用与PCR相同的引物对PCR产物进行测序。使用 BigDye Terminator v1.1 循环测序试剂盒（Applied Biosystems，CA，USA）和 Applied Biosystems 3130 遗传分析仪进行测序反应。基于获得的和先前发表的CDV P基因序列，使用MEGA 11.0软件进行使用Tamura-Nei核苷酸替换模型的最大似然分析[23]。通过引导测试系统发育的可靠性。

3 . 结果
3.1 . 临床病史和检查
在 A 窝（德国西班牙猎犬）中，接种第 1 批疫苗 B (VB1)（表 1 ）的 7 只小狗中有 5 只出现了疾病迹象。其中，三只小狗（A1、A2 和 A3）在接种疫苗后三到四天出现严重的全身性疾病。他们患有高烧、厌食、呕吐、腹泻，并且生长迟缓。这些幼犬接受了静脉输液治疗、全身抗菌药物（氨苄西林或阿莫西林克拉维酸）和皮质类固醇的对症治疗。其中两人接受了细小病毒检测对粪便样本进行快速酶免疫分析，结果呈阴性。两只小狗死亡，一只被安乐死，它们都被送往尸检。此外，兄妹A7在接种疫苗两天后出现发烧和血性腹泻，并在接种四天后因状况不佳而被安乐死。A6 兄弟姐妹在接种疫苗五天后出现腹泻和嗜睡，但已完全康复。兄弟姐妹A4和A5在接种疫苗后没有表现出异常的临床症状。接种疫苗六个月后，所有幸存的狗都活着并且临床健康。

B 窝幼犬 B1（猎狐犬）在 2020 年 1 月首次接种一批疫苗 B (VB2)（表 1）后四个月出现癫痫发作，随后神经状况恶化。这只小狗还患有轻度腹泻，耳朵也有酵母菌感染。到2020年1月末，患者出现肌阵挛、威胁反应增强、头部轻微向左倾斜、本体感觉轻微降低。其脑脊液样本 CDV RT-PCR 呈阳性。这只小狗在 2020 年 2 月初被安乐死之前，曾出现发烧和持续癫痫发作的症状。

小狗B2有阵发性腹泻以及皮肤和耳朵问题的病史。25周龄时首次接种了一批疫苗B（VB5）（表1 ），没有任何疫苗接种相关症状。在第一次和第二次疫苗接种之间，它曾出现腹泻和呕吐，并接受了对症治疗。该幼犬在34周龄时第二次接种另一批疫苗B（VB3）（表1 ），两天后出现粘液脓性角结膜炎。此时，也有消息透露，这只小狗曾出现过短暂的头部发作。前五天一直在晃动。2020 年 2 月，这只小狗在接种疫苗九天后被安乐死，当时的症状发展为发烧、迷失方向、几乎不间断的面部肌阵挛、流口水和下巴打断。三个未受影响的接种疫苗的兄弟姐妹没有表现出任何迹象，并且在接种疫苗六个月后仍然活着并且临床健康。

3.2 . 病理结果
在 A 窝中，所有三只尸检小狗都有类似的病变：所有淋巴器官均明显弥漫性增大（比正常大 2-6 倍），并且出现严重弥漫性坏死性出血，肠道派尔氏集结也出现类似的变化。肠腔内充满了不同数量的深色血腥恶臭液体。肉眼观察，未见其他病变。组织学上，肠相关淋巴组织（GALT）、淋巴结和脾脏中存在大量弥漫性急性至亚急性淋巴细胞溶解和出血性坏死，伴多灶性合胞体细胞，粘膜上皮细胞内有少量胞浆内嗜酸性包涵体（图1）。）。在受影响的集合淋巴结上方可见急性多灶性上皮坏死，并在胸腺中观察到轻度至中度淋巴细胞溶解（图1；补充图1）。这些幼犬还患有多灶性中度急性坏死性化脓性门静脉和小叶肝炎（补充图1 ）。未见脑损伤。其他染色（革兰氏、PAS、ZN、GMS、WS）显示病变中没有致病微生物。肠上皮和淋巴组织、受影响的淋巴结和库普弗细胞以及肝脏炎症细胞中 CDV 的免疫组织化学染色呈高度阳性（图 1；补充图 1））。胸腺和骨髓中的染色也呈中度阳性（补充图 1）。细小病毒和腺病毒的免疫组织化学染色呈阴性。

图。1
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图。1。病例主要病理结果。A. 第一只德国西班牙猎犬小狗 A1 的淋巴结，显示严重坏死和淋巴细胞溶解。HE，棒 = 20 µm。B.生发中心来自与 A 中相同的淋巴结，在生发中心和周围坏死炎症中显示出非常强的犬麻疹病毒免疫标记。条 = 20 µm。C.第一只德国西班牙猎犬小狗A1的小肠，显示肠道相关淋巴组织严重坏死，肠粘膜上皮严重坏死。HE，棒 = 200 µm。D. 靠近 C 区域的小肠，在上皮和淋巴组织病变中均显示出非常强的犬麻疹病毒通用免疫标记。棒 = 200 µm。E. 猎狐犬、小狗 B1 的脑桥，显示明显的亚急性淋巴浆细胞性和组织细胞性脑炎，伴有明显的空泡变性。HE，棒 = 20 µm。F. 来自病变区域 E 的炎症细胞和神经元显示出强烈的犬麻疹病毒免疫标记。条 = 20 µm。

肉眼观察，B窝幼犬B1仅有明显的急性肺水肿，而幼犬B2则无肉眼发现。组织学上，两只幼犬均表现出严重的多灶性亚急性淋巴浆细胞性和组织细胞性脑炎，伴有轴突空泡变性和脱髓鞘，并伴有多灶性淋巴细胞性和组织细胞性血管周围套索（图1 ）。病变位于小狗 B1 的脑桥和延髓，以及小狗 B2 的丘脑。此外，小狗B1患有轻度至中度多灶性亚急性淋巴浆细胞性和组织细胞性间质性肺炎。小狗B2也患有中度慢性化脓性心肌炎和轻度双侧慢性淋巴浆细胞炎结膜炎。两只幼犬脑部免疫组织化学染色均呈CDV高度阳性（图1），幼犬B1的肺和胃粘膜呈中度阳性，幼犬B2的肺部呈轻度阳性。

3.3 . RT-PCR 和测序分析
在 A 窝中，所有研究样本的 CDV P 和 F 基因 RT-PCR 均呈阳性。从组织样本中获得的P和F基因的病毒核苷酸序列与从VB1疫苗样本中获得的序列相同。同样，在 B 窝中，大脑、结膜和脊髓样本的 CDV P 基因 RT-PCR 呈阳性。从窝 B 获得的序列与 VB1 序列 100% 相同。基于系统发育分析（图2），来自窝 A、窝 B 和疫苗 B 的 CDV P 基因序列与之前发表的 CDV Onderstepoort 毒株序列聚集在一起。分析中包括 2015 年从希腊和 2018 年从俄罗斯进口到芬兰的狗的 CDV 序列作为参考，它们与窝 A 和 B 序列分开聚类。获得的CDV序列的GenBank登录号如下：部分P基因：OP242374、OP242375和OP242376，部分F基因：OP242377和OP242378。

图2
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图2 . 使用基于部分 CDV磷蛋白(P) 基因核苷酸序列的 Tamura-Nei 模型的最大似然分析（388bp）。本研究中获得的CDV序列：窝A：小狗A1芬兰（德国西班牙猎犬），窝B：小狗B1芬兰（猎狐梗），疫苗B1。进口狗的序列：从俄罗斯进口的 Dog Finland Vi699 2015，从希腊进口的 Dog Finland vi98 2018。先前发布的 CDV P 序列：Onderstepoort 株 (EU143735)、疫苗 Y (AB212962)、Onderstepoort 株 (NC_001921)、疫苗株 CDV3 (EU726268)、疫苗 Distemink (AY130857)、Dog Japan (AB294371)、疫苗 X (EU072201)、Dog美国 (EU716337)、匈牙利狗 (AJ582385)、德国狗 (AJ582384)、泰国狗 (AB299193)、中国狗 (HQ540292)。树节点上的数字表示 1000 次重复的引导值；70 以下的值不会显示。比例尺表示核苷酸取代。

4 . 讨论
在这里，我们描述了首次经 RT-PCR 证实，疫苗病毒株在两只不同品种的不相关狗窝的小狗的犬瘟热病变中出现。从组织样本中获得的病毒基因序列与疫苗样本相匹配，与临床病史相比，使得疫苗诱发的疾病成为可能的原因。已知血凝素蛋白基因(H) 是CDV 分子流行病学研究的合适靶标。然而，阿尼斯等人。[24]已经证明F和P基因在不同CDV分离株的系统发育分析中产生相似的结果。使用的疫苗株 Onderstepoort 包含在 America-1谱系中CDV，目前不在犬类群体中传播[2]。在芬兰，狗广泛、常规地接种了犬瘟热疫苗，自然疾病极为罕见，自 1995 年以来仅出现零星病例[25]。

A 窝中描述的淋巴组织严重坏死和其他典型犬瘟热部位的相对保留从未在家养犬的自然感染中描述过，可以解释为疫苗接种后犬瘟热新表现的指示性迹象。然而，其他麻疹病毒的淋巴组织坏死是众所周知的并有记录[2]，并且有时在犬瘟热中可见较轻的淋巴细胞坏死[26]、[27] 。在我们的病例中，胸腺相对轻微的病变很有趣，原因有两个：胸腺通常是自然犬瘟热中最常受影响的器官之一，并且与胸腺不同，其他淋巴组织受到严重影响。GALT的标记性派尔氏斑块坏死以前在文献中并未与犬瘟热相关，但其他麻疹病毒（例如牛瘟病毒和小反刍兽疫病毒） 也描述了类似的病变[2] 。CDV 引起的严重肠道损伤很可能导致细菌损伤或菌血症，而坏死化脓性肝炎被解释为对这种细菌损伤的反应性病变，而不是主要由犬瘟热引起的。肝库普弗细胞和骨髓中的免疫组织化学染色阳性归因于感染引起的广泛病毒血症。

在同窝 B 中，体征和病理结果与之前 PVE 的描述相关[13] 。然而，在小狗 B1 中，症状出现的时间比通常描述的 PVE 晚得多，并且临床症状更类似于自然CDV 感染。胃粘膜的中度 CDV 免疫阳性很可能是由病毒的趋上皮倾向引起的，因为没有看到细胞损伤。小狗 B2 的临床症状和病程与文献中描述的相符。然而，由于症状在第二次疫苗接种之前就已经出现，因此疾病过程可能在第一次疫苗接种时就已经开始了。心肌炎​由于其组织学类型，被解释为对旧的损伤（可能是细菌）的慢性反应，而不是由 CDV 感染本身引起。同窝仔鼠之间的差异可能归因于每个个体的个体免疫多样性，但也归因于所使用的不同的疫苗接种计划。尽管小狗 B1 的体征和病程与 PVE 文献中描述的不符，可能与自然感染有关，但 RT-PCR 和测序结果表明感染是疫苗诱导的。这些发现意味着，被认为由天然 CDV 引起的其他疫苗后 CDV 感染实际上可能与疫苗相关，但需要更多的研究来更好地研究和描述疫苗后病例。

除了使用的商业疫苗外，我们受影响的窝中没有出现任何共同点：两窝都有不同的临床病史和病理结果，接种了不同批次的疫苗，时间上相距三年，地理上相距数百公里。所使用的疫苗几十年来已在世界范围内广泛使用，已注射了数亿剂疫苗。在芬兰，大多数犬瘟热疫苗接种都是使用与这些小狗使用的疫苗相同的疫苗进行的。据报道，目前使用的其他犬瘟热疫苗与新西兰犬的疫苗后脑炎有关[9]、[10]、[11]。考虑到所有这些方面，特别是研究中多只同窝仔猪出现疾病体征的事实，遗传因素可能导致病例中免疫失调和体征的发展。许多狗品种是基于侵略性表型选择的结果而开发的，在许多情况下导致高水平的近亲繁殖和遗传多样性 的下降[14]。例如，根据德国西班牙猎犬俱乐部 (Verein für Deutsche Wachtelhunde) 的说法[28]德国西班牙猎犬的繁殖最初仅基于十个族长个体，随后通过几十年来分别近亲繁殖两种颜色变种而进一步缩小范围。这种类型的育种允许表达有害的常染色体隐性基因，这可能会增加免疫性疾病的患病率[14]。有趣的是，在之前报道的另一品种的一窝疫苗后脑炎病例中，受影响狗的父亲也是母亲的父亲，导致基因库直接缩小，并增加了传递有害基因类型的可能性[ 11 ]。遗传免疫病理条件在疫苗相关不良事件中的作用值得进一步研究。此外，不能排除使用不符合建议的疫苗的影响：因为与通常推荐和使用的疫苗接种计划相比，小狗 B2 使用的疫苗计划是标签外的，而且也是非正统的[29]。

该报告的局限性在于样本量较小，因为我们的研究结果基于接种疫苗的狗体内两组不同的 CDV。然而，获得的病毒序列足够长并且与疫苗样本相同，因此我们可以自信地声明感染源自疫苗病毒株。野生动物中偶尔有类似 Onderstepoort 的 CDV 报道[30]，并且由于没有关于芬兰野生动物宿主内 CDV 遗传变异的数据，也没有关于受影响的小狗与其他可能感染的其他动物接触的详细信息对于狗来说，循环疫苗株的自然感染不能完全被证明是错误的。然而，鉴于芬兰的大多数狗都接种了疫苗，并且抗体滴度足够86% [31]中发现了Onderstepoort 菌株，而且目前还没有关于 Onderstepoort 菌株在芬兰野生动物种群中传播的报道，因此在我们的病例中最可能的疾病原因可以假设是疫苗接种。最后，由于我们的样本量较小且临床和病理结果差异很大，因此根据我们的报告无法对疫苗引起的犬瘟热及其体征和病理结果做出显着的概括。

由于两窝报告的临床和病理结果之间存在显着差异，并且一些新的发现以前在疫苗疑似疾病中未曾描述过，因此应该进行更多的研究，重点是通过分子分析确认疫苗诱导的感染，以增进了解与疾病相关的范围、范围和宿主因素。疑似疫苗引起的 CDV 感染应在标记之前通过分子分析进行确认，因为不能仅通过症状和疾病时间来排除自然感染[4] , [32]。由于缺乏病毒分子检测，一些先前描述的疾病病例也可能被误诊为自然病例，因此仅根据临床病史时，疫苗诱发病例的数量可能会被漏诊。在 CDV 不流通的地方尤其应考虑这些因素。

由于许多犬种的遗传多样性正在减少，基于免疫学的挑战可能变得更加普遍，因此应进一步研究免疫学差异和药物遗传学对疫苗安全性的影响。然而，尽管在假设的免疫缺陷个体中出现了这些非常罕见的疫苗诱发病例，但继续为尽可能多的狗接种犬瘟热疫苗以提高群体免疫力至关重要，因为野外病毒仍然对所有未接种疫苗的狗构成严重威胁。疫苗对于有效控制一些最具破坏性的疾病至关重要，因此疫苗的安全性对于持续保护全人类至关重要和动物。区分疫苗诱发的疾病与自然感染对于疾病的监测和控制至关重要。

总之，这项研究首次描述了通过 RT-PCR 和测序证实的在家犬犬瘟热病变中出现的疫苗病毒株，并强调了该疾病在两个独立窝中的截然不同的表现。