1 . 介绍
许多研究表明，细胞内某些成分（如核酸、蛋白质、小分子）在分子水平上的异常水平与亚细胞甚至细胞水平的病理变化密切相关，这些细胞物质可以称为生物标志物。对相关疾病的诊断具有重要意义。1 , 2 , 3 , 4因此，疾病特异性生物标志物的成像和检测可以间接反映细胞是否处于健康状态，有利于疾病诊断和疾病进展评估。然而，生物标志物的丰度较低，大大增加了其检测难度。因此，迫切需要开发准确、灵敏的成像方法。迄今为止，基于DNA纳米技术的成像方法由于DNA纳米结构的近定量产率、高生物稳定性和低免疫原性的内在优势而成为有前途的工具。5 , 6 , 7 , 8

自Seeman等人首次提出DNA结构组装以来， 9 DNA纳米技术得到了迅速发展，并应用于生物力学、生物分析、疾病诊断等众多领域。10 , 11 , 12传统上，DNA作为基因信息的载体被认为是生命所必需的。然而，随着对DNA的深入探索，人们发现了许多令人着迷的特征。由于其空间可寻址性、灵活的设计、易于合成以及固有的优异的生物相容性，DNA被定义为纳米结构组装的优异构建模块，并在纳米技术的发展中发挥着不可或缺的作用。13 , 14由于其独特的特性，特别是基于沃森-克里克碱基配对原理的序列可编程性，DNA可用于构建各种纳米材料，包括动态纳米机器、DNA电路和可重构纳米结构。而且，许多纳米材料已被证明具有较高的细胞摄取效率、增强的抗降解能力、在各类细胞中无明显的细胞毒性，这些都为生物成像领域的巨大进步做出了贡献。15 , 16 , 17其中，DNA纳米机器在特定分子刺激或环境变化时被激活，引起了研究人员的高度关注。18 , 19 , 20, 21 , 22 , 23

近年来，人们已经探索了多种人工设计的 DNA 纳米机器用于生物成像。一般来说，在外部触发器的刺激下，DNA纳米机器可以被激活以移动或改变其构象以完成分子传感。根据组装部件的性质，DNA纳米机器可分为两类：一类是完全由DNA链构成的纳米机器，另一类是借助无机纳米粒子组装而成的纳米机器。完全由DNA制成的纳米机器通常表现出显着的信号放大性能，这有利于低丰度生物标志物的灵敏识别。但由于其细胞渗透性差，在复杂生物环境中的应用受到一定限制。以及对核酸酶降解的敏感性。而涉及无机纳米材料的DNA纳米机器具有改善的细胞摄取和增强的生物稳定性。但无机材料的参与不可避免地增加了合成的复杂性和难度，并在一定程度上存在增加细胞毒性的风险。因此，开发方便、可靠、安全、自传递的纳米机器以实现高信号增益并完成灵敏的生物成像仍然是挑战。

在这篇综述中，首先介绍了DNA纳米机器的基本组装模块，例如静态DNA纳米结构、功能核酸和无机纳米粒子。然后，将用于病变细胞成像的动态DNA纳米机器的最新进展总结为三个部分：（1）RNA响应DNA纳米机器，（2）ATP驱动的DNA纳米机器，（3）pH感应DNA纳米机器。最后，充分讨论了当前DNA纳米机器用于生物成像的挑战和前景。

2 . DNA纳米机器的基本组装模块
在过去的几十年里， DNA的功能不再局限于遗传信息的存储，而是因其高度可控性而被用作构建各种纳米材料的新型构件，应用于纳米科学、纳米工程和纳米医学领域。24 , 25在众多纳米材料中，DNA纳米机器因其独特的模仿多种天然生物分子机器的能​​力而受到广泛关注。19 DNA 纳米机器是计算自组装结构，可通过特定刺激下的可控构象转变来转换定义的状态， 26，27、28已广泛应用于生物成像。一般来说，生物成像纳米机器的工作原理如图1所示。当没有目标分析物或环境没有变化时，纳米机器处于“关闭”状态。相反，当目标分析物存在或环境条件发生变化（如pH、光照）时，纳米机器就会被激活并呈现“ON”状态，从而释放荧光信号，完成生物成像。在本章中，我们将介绍DNA纳米机器的几种不同的基本组装模块，包括静态DNA纳米结构、功能核酸和无机纳米颗粒，以便更好地了解 DNA 纳米机器的构造。

2.1 . DNA纳米结构
基于传统的Watson- Crick碱基配对规则，通过合理的序列设计，DNA可以构建各种有序的2D或3D纳米级结构，如DNA纳米镊子，29、30个DNA四面体，31、32、33个Y形DNA，34、35、36 DNA三棱柱、37 DNA树枝状聚合物、38等。 _ 其中，DNA四面体作为一种简单的三维框架于2004年首次提出，引起了人们的广泛研究兴趣。39一般来说，DNA四面体可以通过几条精心设计的DNA链以快速、方便的单步过程轻松组装而成。而且，DNA四面体的天然刚性结构显着增强了其固有的生物降解性，使其在复杂的环境波动中保持相对完整。此时，DNA四面体常常被集成到不同的纳米机器中作为防护罩，以增强纳米机器的抗干扰能力。例如，黄等人。开发了一种基于双 DNA 四面体的纳米探针，通过一系列催化发夹组装反应进行细胞内miRNA成像。40

同样，由三条DNA链自组装而成的DNA三棱柱也具有保护性刚性结构，可以作为构建纳米机器的支架。最近，徐等人。报道了一种基于 DNA 三棱柱的纳米机器，用于两阶段生物标志物识别和动态生物成像。41在此分步成像策略中，将两个适体 sgc8c 和 P53 引入 DNA 三棱柱上以组装靶向纳米机器。如图2A所示，当纳米机器上的sgc8c适体与PTK7结合时当癌细胞膜上蛋白质过度表达时，Cy3标记的互补链被释放，导致荧光恢复，实现第一阶段成像。然后，细胞质中的p53蛋白与p53适体相互作用，诱导相应互补序列的释放，产生Cy5荧光信号，完成第二阶段成像。此外，DNA树枝状聚合物也被用于组装纳米机器。王等人。设计了一种基于DNA树枝状聚合物的3D DNA行走纳米机器，用于细胞成像，具有良好的方向性和可控性（图2B）。42本研究通过合理设计底物链和DNA树枝状大分子上的限制性脱氧核酶而获得纳米机器，表现出突出的生物稳定性和高抗干扰性能。在目标miRNA分子存在的情况下，在辅因子Mn 2+的帮助下，纳米机器的运动被激活，导致荧光信号增强，最终实现细胞内成像。

基于 DNA 纳米结构的纳米机器，用于活细胞动态生物成像。(A) 由 DNA 三棱柱制成的纳米机器，用于两阶段生物标志物识别和成像。经参考文献许可转载。41. 版权所有 (2022) 爱思唯尔。(B) 基于 DNA 树枝状聚合物的 3D DNA 行走纳米机器，用于生物成像。经参考文献许可转载。42. 版权所有 (2022) 美国化学会。

2.2 . 功能性核酸
迄今为止，许多核酸已被证明表现出有吸引力的特征，例如酶催化、特异性分子识别和治疗作用。24 , 25这些独特的核酸被称为“功能核酸”（FNA），包括适体、核酶、脱氧核糖核酸酶等。由于功能核酸的突出优点，它们被广泛用作功能模块来构建功能DNA纳米机器。其中，DNAzymes和aptamer是最常用的，因此我们在本节中重点关注它们。

2.2.1 . 脱氧核糖核酸酶
脱氧核酶（DNAzyme）是通过体外筛选获得的一类具有催化活性的功能性单链DNA 。43 , 44 , 45由于其卓越的可设计性、易于合成、令人满意的生物相容性、优异的选择性和高灵敏度，多种基于DNAzyme的纳米系统已被开发用于体内。46 , 47 , 48特别是 RNA 切割 DNAzyme 的优点，它可以在特定金属离子（例如 Mg2+、 Cu ）2+、Zn 2+和Na +对于金属离子和miRNA 的检测或成像具有非凡的意义。然而，DNAzymes在活细胞中的应用仍然面临三个重要问题。首先是DNAzymes的内化效率较差。DNAzyme 的负电荷阻止它们穿透细胞膜并进入细胞内部。二是DNAzymes的低酶促降解能力阻碍了其在体内复杂生物环境中的催化效率。最后一个问题是非目标激活过程。如果没有任何保护措施，脱氧核糖核酸酶仍处于活性状态，在金属离子存在下容易被激活，导致非特异性反应并产生假阳性信号。这可能会影响细胞内成像的灵敏度和准确性。因此，人们已经做出了足够的努力来构建复杂且可靠的基于 DNAzyme 的细胞成像纳米机器。详细策略将在第 3 章中讨论。

2.2.2 . 适体
作为功​​能性核酸，适体是能够以高亲和力结合其自身靶分子的短单链寡核苷酸，其通过称为指数富集配体系统进化（SELEX）的选择技术获得。49通常，SELEX 的初始阶段涉及随机 ssRNA 或 ssDNA 序列的大型文库 (10 13 -10 15 )，然后是结合、洗脱、扩增、分离和收集的重复过程。50适配体具有合成重复性好、成本低、目标识别能力强、生物相容性好、修饰可控等优点，常作为辅助模块集成到DNA纳米机器中，实现特异性靶向识别并增强癌细胞的通透性。目前，已报道了许多与肿瘤生物标志物特异性结合的适配体，例如PTK7蛋白的sgc8适配体，核仁素的32、51 AS1411适配体，Mucin 1蛋白的52、53 MUC1适配体，ATP的54、55和ATP适配体。56 , 57

2.3 . 无机纳米颗粒
根据上述介绍，我们了解到结构DNA纳米技术和/或功能核酸常常被用来构建DNA纳米机器。然而，由纯DNA链组装而成的纳米机器容易出现细胞渗透性差且易被酶降解的问题，这不利于其在复杂的生物环境中的应用。58 , 59为了解决这些问题，纳米机器通常与无机纳米粒子结合以增强细胞渗透和核酸酶抗降解性。在这里，我们将介绍两种主要的无机纳米颗粒，它们通常用作构建纳米机器的基本组装模块：金纳米颗粒（AuNP）和上转换纳米颗粒（UCNP）。

2.3.1 . 纳米金
AuNPs具有独特的表面等离振子共振效应、荧光猝灭性能、高生物相容性、大表面积、易于与DNA链功能化等优点。60 , 61这些显着的优势使得AuNP辅助的DNA纳米机器在疾病细胞的诊断和成像中得到了广泛的探索和应用。62 , 63 , 64例如，我们的小组设计了一种基于负载线性 DNA 探针的 AuNP 的刺激响应纳米机器系统，用于通过壳穿透/自由能驱动的自主电路对循环肿瘤细胞 (CTC) 进行超灵敏和特异性检测。65施等人。报道了一种基于 Y 形 DNA 修饰的 AuNP 的双响应 DNA 纳米器件，用于活细胞中两种凋亡信号通路相关生物标志物（细胞色素 c和锰超氧化物歧化酶mRNA）的荧光成像。 66

2.3.2 . UCNPs
作为一种独特的稀土离子掺杂纳米发光体，UCNPs 在近红外 (NIR) 激发的照射下可以产生紫外/可见光发射。67 , 68 UCNPs因其独特的性质而受到足够的关注，例如高组织渗透性、优异的光稳定性、低光损伤和抑制自发荧光。69 , 70 , 71由于这些固有性能，UCNP 已广泛应用于构建用于生物医学成像的光激发 DNA 纳米机器。例如，叶等人。提出了一种基于 UCNP 与DNA 探针组合的近红外光激活 DNA 步行器，用于原位 miRNA 成像。72李等人。展示了一种近红外光驱动的纳米机器，通过将 UCNP 与合理设计的 DNA 四面体耦合来追踪细胞内的 microRNA。73

3 . 用于病变细胞成像的动态 DNA 纳米机器
对于细胞内生物成像来说，理想的工具应具有生物相容性好、无毒副作用、成本低、易于合成、精度高、信噪比高和兼容性好的特点。74然而，构建具有这些功能的可靠工具非常困难。在过去的几十年里， DNA由于其灵活的结构、序列可编程性、优异的生物相容性和高度可控性，作为生物工程和纳米技术的新基石引起了许多研究人员的广泛关注。75 , 76基于 Watson−Crick 碱基配对，可以通过合理的方法有效地利用 DNA 构建形状和尺寸可控的纳米级器件寡核苷酸排列，为强大的生物成像工具的设计和制造提供了新的机会。77 , 78 , 79本节介绍不同类型的刺激响应 DNA 纳米机器。

3.1 . RNA响应DNA纳米机器
3.1.1 . 完全由 DNA 制成的动态纳米机器
由于RNA具有携带编码信息、指导蛋白质合成、调节基因表达等多种独特的生理功能，是生物体不可缺少的。在多种RNA中，许多信使RNA（mRNA）和小微小RNA（miRNA）已被证明与一些疾病的进展有关，因此它们被用作恶性疾病早期诊断和治疗的生物标志物。80、81、82、83、84、85、86 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _尽管已经开发了一系列检测方法来检测RNA，但灵敏度往往受到一对一信号输出的限制，由于RNA表达水平低而阻碍了其应用。近年来，基于信号放大技术的DNA纳米机器被提出。由于具有灵敏度高、扩增效率高、反应条件简单和响应速度快等优点，不同的等温信号放大技术作为聚合酶链式反应（PCR）的可靠替代技术已被广泛研究。87 , 88例如，作为一种无酶过程，杂交链式反应 (HCR) 已被应用于构建生物传感器具有低成本、高性能和技术简单的生物标志物检测优点。89 , 90 , 91最近，HCR 作为一个强大的扩增平台，已被用来开发用于细胞成像的动态 DNA 纳米机器。Jiang的团队提出了一种具有双重功能的miRNA激活纳米机器，即内源miRNA成像和基因沉默。92如图 3 A所示，纳米机器由三个组件组成：(1) Apt-T 诱导 HCR 产生的纳米线，(2) Cy3 标记的 R/HP 双链体，以及 (3) Cy5 标记的燃料DNA（F）。纳米机器可以通过受体介导的内吞作用内化然后被细胞内靶标miRNA激活，引发一系列立足点介导的链置换反应（TSDR）。这导致荧光共振能量转移（FRET）信号并释放大量治疗单位 HP 进一步裂解目标 EGR-1 mRNA。基于放大的FRET信号的DNA纳米机器的检测限为17.8 pM，实现了生物成像。

在另一项研究中，93催化发夹组装（CHA）被用来在活细胞中组装树突状DNA纳米器件。在这项研究中，由专门设计的发夹H1、H2、H3和Y形支架形成的发夹三聚体被转染到细胞中。在 miR-155（引发剂）存在的情况下，触发连续的链置换反应，导致 DNA树枝状聚合物的形成并获得放大的荧光信号输出。93 与传统的CHA不同，基于支化催化发夹组件（bCHA）的催化装置借助“扩散效应”显示出增强的信号放大效率。最近，我们的团队推出了一种用于细胞内 miRNA 成像的智能分子机器。94分子机器由两个主要部件组成：与目标类似物结合的 DNA 发夹和无活性的酶。使用脂质体将机器运送到细胞中后，目标miRNA可以激活DNAzyme，产生荧光信号，并释放目标类似物以激活下一轮DNAzyme裂解反应。分子机器经过周期性刺激后，以自主反馈的方式实现信号增强效果，最终实现目标miRNA的灵敏成像。

除了信号放大技术之外，各种DNA框架纳米结构也被用来构建用于细胞内成像的纳米机器。他等人。报道了一种基于 DNA 四面体的熵驱动 DNA 放大器，用于细胞成像。58这种对活细胞中特定 mRNA 分子做出反应的 DNA 放大器由两种 DNA 四面体组成：熵信标四面体和燃料四面体。58一旦目标 mRNA 与 DNA 放大器结合，mRNA/DNA 放大器之间的相互作用就会导致荧光团 (FAM) 与熵信标四面体中的猝灭剂 (Dabcyl) 有效物理分离，从而产生巨大的荧光信号恢复。四面体框架增强细胞内化DNA放大器的能力和生物稳定性，为纳米机器在体内的应用创造了先决条件。除了DNA四面体之外，简单的DNA环也可以用来构建动态纳米机器。例如，Yang等人开发了一种基于两个DNA环和一个单链DNA的三维纳米机器。95如图 3 B所示，首先，借助接头 DNA（LD1 和 LD2）和不同的酶制备双环，即内环（连接环 1）和外环（连接环 2）。随后，引入助理连接器（AsL）作为连接双环的桥梁，用于组装类轨道电子3D DNA纳米机器。因为荧光染料环2上附着的(FAM)远离环1标记的猝灭剂(BHQ 1)，纳米机器输出强烈的荧光信号。在目标 microRNA-21 存在的情况下，两个环转动并将 BHQ1 和 FAM 拉得很近，导致荧光信号猝灭。然而，连接酶的参与增加了测定实验的成本。在另一项研究中，通过简单的模块化设计组装了嵌入惰性 DNAzyme 的DNA三棱柱，用于活细胞中的目标 microRNA-21 (miR-21) 成像。96由三个单链组装而成的三棱柱用作支架，通过DNA 序列加载惰性 DNAzyme 基序（包含两个分裂 DNAzyme 和一个底物链）互补杂交。高度集成的纳米机器进入细胞后，DNAzyme 响应 miR-21 转变为活性状态，形成催化裂解电路，可以裂解底物并产生放大的荧光信号输出。

3.1.2 . 基于DNA-无机杂化物的动态纳米机器
由于DNA序列的多样性和碱基配对的高度特异性，许多DNA纳米机器已经通过DNA自组装来构建。97 , 98然而，仅含有少量DNA成分的纳米机器往往存在细胞通透性差、生物稳定性差的缺陷。97 , 98由于无机纳米材料的独特性质，DNA-无机混合纳米机器由不同的团队构建99 ，并为复杂生物环境中的光学成像提供了新的见解。例如，金纳米粒子（AuNPs）凭借自然等离子体特性、易于表面功能化而被广泛用于开发智能纳米机器、尺寸可调、高负载能力、优异的生物相容性和高细胞转染率。61 , 100 , 101 , 102最近，Yu 等人提出了一种肿瘤相关 mRNA 响应性 DNA-Au 纳米机器。用于原位成像和癌症治疗。60在这项研究中，三个功能性 DNA 模块首先通过 Au-S 键组装到 AuNP 表面。然后，四种不同的药物被整合到纳米机器中。内源性mRNA内化至靶细胞后，可通过一系列DNA链触发纳米机器的运转位移级联，导致AuNPs的荧光恢复和聚集，从而实现细胞成像。同时，四种药物也被激活，实现多模式协同肿瘤治疗。

近年来，DNAzyme 因其在特定刺激下催化生物转化的能力而被广泛探索用于开发 DNA-walker 介导的纳米机器。103 , 104 , 105然而，DNAzyme 通常需要足够的辅因子（例如金属离子）来维持其有效运行。由于细胞内金属离子水平可能不足，DNAzyme驱动的步行器在体内的应用受到限制。为了解决这个问题，Gao 等人。首先报道了一种光控自驱动自主三维 DNA 纳米机器，可以响应 microRNA 进行细胞内成像。106如图所示图4A，由光裂解（PC）接头嵌入的锁定链与含有Zn 2+依赖性DNAzyme的步行链杂交，然后将所得双链和底物链固定在AuNPs的表面上，获得3D DNA walker，然后用聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 分子进行处理。随后，将表面活性剂稳定的 DNA walker 加载到酸敏感的 ZIF-8 纳米颗粒中。纳米复合材料进入溶酶体后，在酸性环境中崩解并释放出足够的锌离子。365 nm紫外光照射后，PC 连接器被切割。在这种情况下，DNAzyme能够被内源性靶标miRNA-21激活，裂解底物并在AuNP表面进行自驱动行走过程，从而恢复预猝灭的荧光，完成靶标的成像miRNA。在该系统中，ZIF-8纳米粒子（一种金属有机框架）被用作辅助因子的强大来源，与添加额外的金属离子相比，可以有效简化传感过程并减少对细胞物理性质的影响。细胞。DNAzyme 也是由 Cui 等人设计的。作为构建智能纳米机器的酸敏感前体，用于灵敏传感活细胞中的目标 miRNA。107负载在 AuNP 表面的包含 4 条 DNA 链的 DNA-walker 前体在溶酶体的酸性环境（pH 4.5-5.0）下经历了从线性到三链体的构型转换，从而在与目标 miRNA 相互作用时形成活性催化核心。细胞质（pH 7.2）和放大荧光信号的产生。基于DNAzyme的纳米机器的这种双重响应机制可以有效防止纳米机器在递送至细胞的过程中受到细胞外环境中非特异性生物分子的刺激，从而减少假阳性信号。在另一个光驱动纳米机器中，芘被用作 DNAzyme 类似物。当紫外光和目标 miRNA 同时存在时，纳米机器可以被激活以执行 DNA 链切割和荧光信号恢复。108由于消除了对辅因子和 RNA主链的要求，芘辅助纳米机器已经实现了令人满意的生物稳定性和性能。然而，缺乏细胞特异性靶向能力是这些纳米机器的弱点。为了克服这个障碍，陈等人。建立了基于癌细胞膜封装的 AuNP 的 DNA 纳米机器。109通过冷冻标记方法将FAM修饰的DNA发夹H1排列到AuNP上，然后将Au-DNA复合物和另一个发夹H2封装到癌细胞膜中。利用癌细胞膜的归巢靶向能力，DNA纳米机器成功内化到靶细胞中。在目标miRNA存在的情况下，纳米机器被激活，触发CHA反应，使FAM荧光基团远离AuNP表面，从而恢复预猝灭的荧光。

由于DNA的核酸酶抗性较差，复杂生物环境中的RNA检测仍然具有挑战性。因此，增强DNA纳米材料的生物稳定性对于准确检测特定RNA至关重要。在此基础上，我们课题组报道了一种用于活细胞miRNA成像的自我保护DNAzyme纳米机器，该纳米机器表现出增强的血清耐受性和催化活性。63如图 4 B所示，将两侧有外臂和内臂、中间有腺苷核糖核苷酸（rA）的底物（S）链固定在 AuNP 表面，然后将其臂中的互补序列用于与 Mg 2+杂交依赖DNA酶(E)。最后，获得了由AuNP核和带有保护罩的核酸保护壳组成的AuNP介导的DNA纳米机器。在目标miRNA不存在的情况下，通过目标结合结构域分离DNAzyme的催化核心，从而阻断DNAzyme的裂解活性，并且荧光信号被AuNP猝灭。一旦到达细胞内目的地，在没有辅助能量供应的情况下，miRNA激活的DNAzyme walker在AuNP表面上的逐步运动引起底物的连续裂解，导致荧光强度急剧增加。更重要的是，保护盾由拱形结构变为稳定性增强的双链DNA环状凸起，显着增强了抗病毒能力。DNAzyme 的酶促降解并延长活细胞中的成像时间。

除了 AuNP 之外，其他纳米材料也可用于构建 RNA 响应纳米机器。例如，凭借半导体量子点（QD）有吸引力的光物理特性，Ma 等人。报道了一种基于 QD 的生物传感器，用于灵敏检测活细胞中的 miRNA。110元课题组开发了一种基于硅支撑的生物相容性脂质双层的自供电DNA纳米机器，无需辅助酶或燃料链的参与，即可实现高运动效率并完成精确的目标miRNA成像。111

在3.1节中，总结了两种类型的RNA响应纳米机器：一种完全由DNA组成，另一种由DNA-无机混合物组成。完全由DNA组装而成的纳米机器的明显优势在于设计灵活、合成简单、生物相容性良好。然而，生物稳定性和细胞渗透性不足可能限制其进一步应用。相比之下，基于DNA-无机杂化物的纳米机器具有增强的耐酶性、多功能性和出色的细胞摄取等优点，但构建过程相对繁琐，并且在体内应用之前需要解决慢性毒性的潜在安全问题。

3.2 . ATP驱动的DNA纳米机器
三磷酸腺苷（ATP）分子作为重要的能量来源，在生物体的代谢过程、生化合成和信号转导过程中发挥着不可或缺的作用。112 , 113 , 114 ATP稳态失衡与许多疾病密切相关，包括帕金森病、癌症、心血管病等。115 , 116 , 117 , 118因此，迫切需要开发安全可靠的工具，对疾病指标 ATP 进行灵敏成像，以用于临床诊断。近年来，人们致力于设计用于 ATP 成像的动态纳米机器。例如，Li的团队首先报道了一种用于细胞内ATP传感的近红外（NIR）光激活DNA纳米器件（图5A）。68在这项研究中，使用紫外光激活的锁定适体探针和近红外激活的镧系元素掺杂上转换纳米粒子 (UCNP) 来构建纳米器件。近红外光照射后，UCNPs可以吸收近红外光并将其转化为紫外光，实现适体探针上光裂解（PC）基团的光解，松开锁。ATP 的结合可以使适体改变其构象，剥离裂解的 PC 抑制剂并产生显着放大的荧光信号。与紫外线控制的纳米机器相比，这种近红外激活的纳米机器具有更小的光损伤和更深的穿透能力。为了赋予纳米机器对病变细胞的双重生物标志物进行成像的能力，Zhou 等人。设计了一种基于纳米探针的可协同激活的纳米机器，用于肿瘤细胞成像。119一旦内化到肿瘤细胞中，过度表达的 GSH 可以刺激纳米探针分解游离辅因子 Mn 2+，释放的由分裂的适体/DNA酶组成的适体酶可以响应ATP而发生构象变化，执行底物链切割并产生光信号输出。

用于生物成像的 ATP 驱动的 DNA 纳米机器。(A) 近红外光激活 DNA 纳米装置，用于演示细胞内 ATP 传感。经参考文献许可转载。68. 版权所有 (2018) 美国化学会。(B) 使用光调节探针和金属有机框架进行 ATP 成像的智能 DNA 纳米装置。经参考文献许可转载。127. 版权所有 (2021) 美国化学会。(C) 构建用于活细胞中 ATP 成像的 ATP 激活纳米传感器。经参考文献许可转载。[ 131 ]。版权所有 (2022) 爱思唯尔。

有效的信号放大可以显着提高纳米机器的检测性能。最近，高等人。通过将 HCR 的有吸引力的扩增能力与 DNAzyme 的催化裂解相结合，提出了一种自催化驱动的适体传感器，用于活细胞中的 ATP 或凝血酶成像。120基于反馈 DNA 电路的适体传感器包含两个关键单元，一个 ATP 识别单元和一个信号放大单元。识别单元负责靶标结合和HCR的启动，而放大单元可以在DNAzyme的帮助下进行HCR放大，获得指数信号增益。由于亚细胞器包括溶酶体、线粒体、细胞核等，在生物代谢中发挥着重要作用，各种研究一直致力于探索亚细胞成像。121 , 122除了简单的细胞内 ATP 成像之外，还开发了使用 ATP 的特定亚细胞成像。杜等人。报道了一种基于框架核酸（FNA）的纳米器件，用于细胞内溶酶体成像，通过特异性响应溶酶体区室中的 ATP 和质子激活来实现亚细胞成像。123在缺氧条件下，亚细胞器中的一些生物标志物可能会发生令人难以置信的变化，例如溶酶体中的氢离子和线粒体中的 ATP。124 , 125，126鉴于这些，Liu 等人。通过将光调节探针引入缺氧引发的金属有机框架中，构建了一种智能 DNA 纳米装置，用于亚细胞器（线粒体）中的 ATP 成像（图 5 B）。127在这项工作中，含有 PC 连接子和 ATP 适体的 Y 形DNA 探针通过静电相互作用吸附到还原酶敏感的 MOF 表面，形成能够监测线粒体 ATP 的复杂纳米器件。在癌细胞的缺氧环境下，高表达的还原酶诱导MOF崩解，导致Y形探针的释放。依靠花青染料具有靶向线粒体的功能，游离探针进入线粒体。然后，在双光子 (TP) 照射下，PC 连接器被裂解并激活对 ATP 的响应，导致显着的状态转变（从“FRET ON”到“FRET OFF”）。这种高度集成的纳米器件可以监测活细胞甚至荷瘤小鼠组织，为亚细胞成像时空可控策略的开发提供新思路。

由于成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的迷人特性，CRISPR系统作为一种强大的基因编辑工具已应用于医学诊断、生物传感器、生物医学等各个领域。128 , 129 , 130通过与 ATP 激活的纳米传感器相结合，CRISPR/适体系统被构建为活细胞甚至动物中 ATP 成像的有效工具。131本研究中，空心共价有机框架（COF）作为CRISPR/适配体系统的保护壳，可以提高内化效率，提高抗干扰性能，并防止在没有ATP的情况下发生不需要的构象转变（图1）。 5C）。更重要的是，只有当ATP存在时，CRISPR/适配体系统才能被激活，照亮细胞进行成像。

ATP 在肿瘤微环境 (TME) 中具有极高浓度 (100–500 μM)，有助于 TME 的形成并支持肿瘤生长。132 , 133 , 134 , 135因此，除了细胞内 ATP 激活的纳米机器之外，许多研究致力于设计响应细胞外 ATP 的纳米机器，用于癌症诊断和治疗。例如，Li 的团队通过将 pH 插入肽与基于 ATP 适体的探针集成，设计了一种 TME 驱动的纳米机器。136当引入TME时，低pH激活肽被固定在癌细胞表面，细胞外ATP诱导适体结构变化，导致荧光状态从“OFF”转变为“ON”，产生高荧光信号。该纳米机器在 ATP 可视化方面表现出高特异性和高效性能。过度表达的细胞外ATP不仅在肿瘤转移中发挥重要作用，而且刺激肿瘤细胞释放金属蛋白酶（如MMP2/9），从而促进肿瘤转移。134 , 137 , 138因此，促转移生物标志物（例如ATP和MMP2/9）的敏感成像可以为深入了解癌症转移提供宝贵的信息。为此，李的团队展示了一种智能DNA纳米装置，通过将双功能PNA/肽混合体与适体技术相结合，能够对TME中的双促转移靶标进行空间选择性成像。139受与门成像的启发，多变量门控纳米器件是通过将猝灭剂标记的 ATP 适体链 (AtQ) 与包含 AS1411 适体 (CA) 和 PNA/肽共聚物(PmP)的 Cy5 修饰的互补 DNA 链顺序杂交而提出的。 。CA 中的 AS1411 适体负责通过特异性结合将纳米装置锚定在肿瘤细胞膜上核仁素，而 PmP 和 AtQ 分别负责响应 MMP2/9 和 ATP。只有当双靶点MMP2/9和ATP在胞外TME中共存时，纳米器件的构型才会从“OFF”状态变为“ON”状态，从而导致荧光基团的充分释放，并实现两种物质的空间限制分析。促转移靶点。

上述纳米机器虽然可以实现细胞外TME中生物分子的精确检测，但响应时间不够快（需要几十分钟）。为了提高响应时间，Zhao 等人。推出了一种快速响应的自磷酸化 DNAzyme 传感器 (SPDz)，用于在亚秒级时间内检测细胞外 ATP。140 SPDz 传感器可以锚定在细胞膜表面并提供强大的荧光信号，从而能够监测不同刺激（包括应激刺激和机械刺激）下释放的内源 ATP，并显示出高时间分辨率和出色的特异性。

本节介绍的DNA纳米机器的共同点在于需要ATP被激活，不同之处在于组装元件的多样性。例如，UCNP和PC修饰的适配体探针组合可用于构建近红外光激活纳米机器，特殊设计的分割适配体可与DNAzyme结合实现细胞内双生物标志物的成像，有效的信号放大技术可提高细胞内双生物标志物的成像效率。纳米机器的成像灵敏度。简而言之，在设计过程中选择合适的构建组件可以满足可靠纳米机器的特定要求。

3.3 . pH 感应 DNA 纳米机器
细胞内或细胞外pH是与各种病理和生理状态相关的重要参数。pH值异常被认为是多种疾病的典型特征，如癌症、心肌缺血、糖尿病等。141 , 142 , 143因此，细胞水平的pH传感对于疾病诊断和细胞行为探索具有重要意义。因此，刘等人。提出了一种用于细胞外 pH 成像的 pH 响应动态 DNA 纳米镊子。该智能纳米机器由多条胆固醇修饰的DNA链组成，提供了多个锚定在细胞膜上的位点，使纳米机器在细胞膜上更加稳定，减少脱离。当遇到酸性微环境时，锚定在细胞表面的纳米机器发生从三链体到双链体结构的构象转变，从而诱导荧光增强。144在另一项研究中，Wang 的团队报告了一种 pH 可激活的纳米装置，其中含有用于患病细胞成像和基因治疗的分裂 DNAzyme。145如图6A所示，将原始DNAzyme合理设计成两个分裂片段（M1和M2），然后通过引入两个i-motif模块（I1和I2）封闭分裂DNAzyme的粘端，组装成单分散的DNAzyme。显示荧光猝灭和裂解无能的纳米器件（M1 I和 M2 I ）。在正常细胞外环境的生理pH下，M1I和M2I处于惰性状态。当遇到酸性肿瘤微环境时，基序模块转化为四联体结构并偏离M1和M2，导致M1和M2中的荧光恢复和粘性末端暴露。随后，M1和M2通过粘性末端之间的相互作用连接在一起，形成大体积的sDz-ND。由于颗粒尺寸的增加和适体-受体相互作用，纳米器件可以成功地内化到癌细胞中以实现基因沉默。

用于细胞成像的 pH 传感 DNA 纳米机器。(A) 一种基于分裂 DNAzyme 的 pH 可激活纳米装置，用于患病细胞成像和基因治疗。经参考文献许可转载。145. 版权所有 (2021) 美国化学会。(B) 由 DNA 三棱柱组装而成的 3D 纳米机器，用于细胞内 pH成像。经参考文献许可转载。146. 版权所有 (2019) 美国化学会。(C) 一种可远程控制的纳米机器，通过光响应 DNA 基序和上转换纳米粒子的组合进行 pH 敏感传感。经参考文献许可转载。147. 版权所有 (2020) 美国化学会。

除了细胞外 pH 传感之外，Zhou 等人。报道了一种由 DNA 三棱柱构建的 3D 纳米机器，用于细胞内 pH成像。146如图6所示B、纳米机器能够自动进入溶酶体并被酸性环境激活，导致I链中的i-motif转化为分子内的i-四链体，大大缩短了荧光基团Cy3和Cy5之间的距离，从而产生FRET 信号。当纳米机器逃离溶酶体时，细胞质的中性条件使纳米机器恢复延伸状态并阻断FRET信号。可逆纳米机器可以实现外部刺激下pH波动的可视化，并在胞吞过程中实现时空pH变化。在另一项研究中，通过将光响应 DNA 基序与上转换纳米粒子耦合，设计了一种远程可控纳米机器，用于细胞甚至荷瘤小鼠中的 pH 敏感传感。147通过将 PC 控制元件合理设计成 i-motif 结构，得到了紫外光激活的 DNA 模块，并进一步引入 UCNP（NIR-to-UV 传感器），形成精确控制的纳米机器（图6） C）。只有在光照射和酸性pH值共同激活的情况下，纳米机器才能被激活以进行时间分辨和非侵入性控制的pH值传感。此外，DNA-AuNPs缀合物还被用来构建酸响应纳米器件，通过完成双链体到三链体的转变来实现精确的溶酶体成像。148此外，基于 DNA 三链体纳米开关的 pH 响应纳米机器也可用于对细胞通信进行编程。149

本节重点介绍基于细胞外或细胞内 pH 响应进行细胞成像的纳米机器。与用于内源性 pH 传感的纳米机器相比，外源性 pH 响应纳米机器通常需要锚定在细胞膜上。上述大多数 pH 传感策略都利用 DNA 成分，这些成分在暴露于酸性环境时会发生构象变化，例如 i-motif 和 DNA 三联体。UCNP 和光学元件的协同功能可实现可控的 pH 传感。

3.4 . 金属离子激活DNA纳米机器
金属离子在维持正常的生物过程中发挥着不可或缺的作用，150 , 151，细胞内金属离子的不平衡与严重的疾病有关。152 , 153 , 154因此，它们的细胞内成像对于阐明金属离子与疾病之间的机制极其重要。为了实现这一目标，已经开发了多种金属离子激活的纳米机器用于病变细胞成像。155、156、157例如， Yang等人。提出了一种基于双光子（TP）探针的智能纳米器件，用于细胞甚至组织中Zn 2+的成像。158基于 TP 探针的纳米器件具有减弱光损伤、增强穿透性和减少组织自发荧光的特性。此外，该纳米器件具有较高的特异性，仅能被Zn2+进行成像。在另一项研究中， 159光锁定 DNA 纳米机器可以通过单次 NIR 照射在时空上激活，并在疾病细胞中2+此外，崔等人。展示了一种智能纳米装置，可以控制 DNAzyme 活性，从而对细胞内多种金属离子进行灵敏成像。160

最近，Li 的研究小组设计了一种针对细胞器的纳米装置，通过将 UCNP 与光学可控 DNAzyme 偶联，对癌细胞线粒体中的Zn 2+进行特异性成像。161在这项研究中，TPP 修饰的 UCNP 将紫外线控制的 DNAzyme 携带到细胞中，并发挥靶向线粒体的功能。随后，含有 PC 连接体的 DNAzyme 在紫外光刺激下经历了从惰性到活性的转变。一旦在线粒体内遇到Zn 2+ ，激活的DNAzyme开始裂解底物链，释放荧光信号以实现金属离子成像。

大多数上述金属离子可激活纳米机器可以被细胞外近红外时空激活，并进一步被细胞内目标金属离子激活。通过巧妙设计的元件，这些金属离子响应纳米机器可以对特定器官、细胞或组织进行成像。

4 . 结论与展望
迄今为止，人们已付出大量努力来实施基于动态 DNA 纳米机器的平台，用于细胞和有机体水平的生物成像。在本综述中，我们总结了近年来用于病变细胞放大成像的智能DNA纳米机器。用于生物成像的动态DNA纳米机器的进展已经从基本构建模块展示到不同类型的刺激响应纳米机器，包括RNA响应DNA纳米机器、ATP驱动的DNA纳米机器和pH传感DNA纳米机器。通过将 DNA 的可寻址性、多功能性和可编程性与无机纳米材料的高表面积和易于功能化的特性相结合，复杂的 DNA 纳米机器表现出各种独特的化学和物理特征。在这些功能中，智能瞄准能力和逻辑操作能力是最吸引人的。一般来说，在没有目标的情况下，纳米机器保持在“关闭”或“开启”状态。在刺激目标后，纳米机器会改变其配置，从而转变为“开”或“关”状态。为了实现智能靶向和智能操作，纳米机器通常配备有特定的DNA纳米级框架、功能性核酸和/或无机金属纳米颗粒。总的来说，特殊的纳米框架，如刚性 DNA 四面体和 DNA 三棱柱，可以增强 DNA 纳米机器的抵抗力 纳米机器改变其配置，从而转变为“开”或“关”状态。为了实现智能靶向和智能操作，纳米机器通常配备有特定的DNA纳米级框架、功能性核酸和/或无机金属纳米颗粒。总的来说，特殊的纳米框架，如刚性 DNA 四面体和 DNA 三棱柱，可以增强 DNA 纳米机器的抵抗力 纳米机器改变其配置，从而转变为“开”或“关”状态。为了实现智能靶向和智能操作，纳米机器通常配备有特定的DNA纳米级框架、功能性核酸和/或无机金属纳米颗粒。总的来说，特殊的纳米框架，如刚性 DNA 四面体和 DNA 三棱柱，可以增强 DNA 纳米机器的抵抗力酶降解，有利于纳米机器在复杂生物环境中的正常运行。功能性核酸（如适体）的特异性识别能力使得纳米机器具有细胞穿透能力或使纳米机器在特定环境下对目标分析物做出反应，产生预期信号。无机纳米颗粒，例如具有高 DNA 负载效率的 AuNP，使纳米机器易于功能化。UCNP 独特的光传导特性（近红外光到紫外光）赋予纳米机器光响应能力和远程控制能力。在此背景下，已经建立了许多动态 DNA 纳米机器，用于活细胞甚至整个生物体的成像。

然而，基于动态 DNA 纳米机器的生物成像的应用仍然存在一些挑战。挑战之一是特定细胞识别。高细胞穿透性是纳米机器执行细胞成像的先决条件。尽管已经做出了许多努力来构建无需额外转染试剂即可内化到细胞中的纳米机器，但能够特异性识别靶细胞的DNA纳米机器的开发仍然不常见。非靶细胞对DNA纳米机器的摄取会降低纳米机器的浓度，这可能会导致成像灵敏度的损失和假阳性信号的产生。此外，相当多的DNA纳米机器缺乏足够的核酸酶抗性，这限制了它们在体内的应用。设计刚性纳米结构或与无机纳米材料集成可以增强DNA纳米机器对酶促降解的抵抗力，但合理设计这些组件以让纳米机器同时展现多种优势并不容易。