1 . 介绍
硒（Se）是人体健康不可缺少的微量元素，在清除自由基、平衡氧化还原反应、预防癌症、增强免疫力等方面具有一系列重要作用。1 , 2硒的重要性引起了人们的广泛关注，因为缺硒会引发冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病甚至癌症。3在日常饮食中添加蔬菜、西红柿等富硒农产品，无疑是增加人体硒摄入量的理想选择。4富含硒的豆芽不仅具有更高的营养价值和化学预防特性，而且生长周期短，使其成为膳食硒补充剂的理想选择。5在栽培富硒豆芽中，最常用的富硒技术是在高硒土壤中种植植物、叶面处理硒溶液、播种前用硒溶液浸种以及在含硒营养液中水培。6 , 7 , 8然而，大多数土壤中的硒含量较低，特别是在中国、英国、澳大利亚、新西兰、印度部分地区和东欧，9 , 10这使得低硒农产品难以满足基本营养需求。近年来，许多研究人员采用不同的方法来增加作物中的硒含量，最常用的在植物中积累更多硒的方法是喷施硒肥。11亚硒酸盐和硒酸盐是外源无机硒的两种主要形式，通常通过肥料补充，但过量的硒以亚硒酸盐和硒酸盐形式随雨水流入水系统，导致动物死亡和人类出现有害症状。12 , 13 , 14 施用传统无机硒肥对土壤和环境的不利影响促使人们探索替代性硒肥。近几十年来，人们对含硒多糖的制备、结构和生物活性进行了大量的研究。15与无机硒化合物相比，含硒多糖，包括绿茶多糖、海藻多糖苍白球多糖、Hohenbuehelia serotina多糖、菌丝体多糖和大蒜多糖具有许多良好的特性，如较低的毒性、较高的生物相容性和较好的多种生物活性。据我们所知，很少有报道研究含硒多糖对植物的富硒作用。此外，所有上述多糖在自然界中都极其稀有，可能需要一系列复杂的分离和纯化，涉及高昂的成本才能获得， 16 , 17这限制了它们在农业中的应用。

壳聚糖是一种氨基多糖，可由甲壳素脱乙酰化而得。此外，甲壳素是第二丰富和可再生的天然高分子18 , 19，可以从蟹和虾的甲壳以及真菌和藻类的细胞膜中提取20此外，壳聚糖是一种可生物降解且具有生物相容性的多糖，成本低廉，在食品和农业领域有着广泛的应用。21 , 22 , 23与其他多糖相比，壳聚糖不仅具有丰富的羟基还有高活性氨基，可以作为多个硒化位点。24最近的研究表明，硒壳聚糖对鱼和鸡等动物具有有益影响。25 , 26然而，Se-壳聚糖对植物生长和硒积累的影响知之甚少。

水凝胶是具有三维网络结构的聚合物，具有保存水分和营养物质的能力，在食品和农业领域得到了广泛的研究。27琼脂糖水凝胶是一种很有前途的材料，可作为豆芽富硒培养的理想天然基质，因为其多孔结构允许氧和含硒化合物扩散并储存在水凝胶中。28在我们之前的研究中，我们成功制备了硒-琼脂糖杂化水凝胶，并将其应用于豆芽富硒培养。14 结果表明，硒-琼脂糖杂化水凝胶作为可回收的天然基质，为植物富硒提供了一种简单、可持续且负担得起的策略。该方法可能有利于提高富硒资源的利用率，避免富硒种植过程中向环境引入化学污染。为了扩大其在富硒农业中的应用，琼脂糖水凝胶有必要与其他可降解的功能性含硒化合物（例如硒壳聚糖）复合。

在此，我们报道了一种基于硒壳聚糖和琼脂糖的富硒基质，可以实现豆芽富硒的目的，如图1所示。以HAc为催化剂，采用冰醋酸-亚硒酸钠(HAc-Na 2 SeO 3 )法合成硒壳聚糖。然后，将Se-壳聚糖溶液与琼脂糖溶液混合，制备掺杂Se-壳聚糖的琼脂糖水凝胶。芽培养试验表明，掺有硒壳聚糖水凝胶的琼脂糖可以作为支持芽生长的基质，并且硒壳聚糖形式的硒可以被芽吸收。我们目前的工作提供了一种新颖且简单的策略来实现植物中的富硒。

2 . 材料和方法
2.1 . 材料
琼脂糖（琼脂，生化用，硫酸盐≤0.15%，凝胶强度（1%）>1200 g/cm3，水分含量<10%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。脱乙酰度90%的壳聚糖（CS）粉末购自桓台县金湖甲壳制品有限公司（中国淄博）。亚硒酸盐（≥97%）和硝酸（AR）购自国药化学试剂有限公司（中国苏州）。冰醋酸（HAc，AR，≥99.5%）购自江苏强盛功能化工有限公司（中国苏州）。去离子水是在实验室制备的。所有化学品均未经任何纯化而使用。绿豆种子购自马培忠农产品(中国商丘)。

2.2 . 壳聚糖的制备
Se-壳聚糖是按照 Chu 等人的描述制造的。经过一些修改。26简而言之，将 CS 粉末（0.5 g）放入 40 mL 去离子水中，室温搅拌 30 分钟，加入 1 mL 冰醋酸，剧烈搅拌混合物直至混合物澄清透明。然后，将Na 2 SeO 3 (0.536 g)溶解在10 mL DI水中并添加到HAc-CS溶剂中。我们将混合物转移到水浴中并在 70°C 下搅拌 6 小时。反应结束后，将CS溶液冷却至室温，并用三重无水乙醇在4℃下沉淀过夜。离心后沉淀用75%乙醇洗涤3次，真空冻干冷冻干燥机和地面。

2.3 . 琼脂/壳聚糖复合水凝胶的制备
采用简单的溶剂模板法制备了琼脂/Se-壳聚糖复合水凝胶。通常，将琼脂糖粉末 (1.0 g) 溶解在 95 °C 的去离子水中，并将溶液冷却至 60 °C。然后，通过滴加一定量的Se-壳聚糖溶液，将不同浓度的Se加入到琼脂糖水溶液中。之后，搅拌混合溶液，倒入圆柱形模具中并冷却至室温，形成琼脂/Se-壳聚糖复合水凝胶。琼脂糖浓度为1.0% (w/v)。琼脂/Se-壳聚糖复合水凝胶中Se浓度分别为400 μg/L、800 μg/L、1200 μg/L和1600 μg/L，记为Agar/Se-chitosan-Se (400 μg/L)、Agar分别为/Se-壳聚糖-Se (800 μg/L)、琼脂/Se-壳聚糖-Se (1200 μg/L) 和琼脂/Se-壳聚糖-Se (1600 μg/L)。同时，还如上所述制备纯琼脂糖水凝胶并表示为琼脂（对照）。

2.4 . 特性描述
2.4.1 . 红外光谱
使用FTIR光谱仪（Nicolet iS50，美国）获得壳聚糖、Se-壳聚糖、琼脂（对照）和琼脂/Se-壳聚糖-Se（1600 μg/L）的FTIR光谱，范围从4000 cm -1 到500 cm - 1 . 测试样品采用 KBr 盘法制备。

2.4.2 . X射线衍射
使用 X 射线衍射仪（ Bruker AXS，德国）从 2θ  =  10°–80°，使用 Cu-Kα 辐射，扫描速率为 5°/min。

2.4.3 . 扫描电镜
将琼脂（对照）和琼脂/Se-壳聚糖-Se (1600 μg/L) 在真空冷冻干燥机中冻干。水凝胶在液氮中破裂，样品的横截面涂有Au以增加电导率，并通过SEM（SU1510，日本）观察。

2.4.4 . 热重分析
使用热重分析设备（TGA/DSC 3+，瑞士）对壳聚糖和Se-壳聚糖进行热重分析（TGA）。将约8mg样品放置在铝坩埚中并在氮气气氛中以10℃min -1的加热速率从30℃加热至800℃ 。

2.4.5 . 紫外光谱
将壳聚糖和 Se-壳聚糖溶解在 2% (v/v) HAc 溶液中，制成 0.5 mg/mL 的溶液。使用紫外光谱仪（Hach-DR600，美国）测量制备样品的紫外光谱，范围为 400 至 200 nm，使用 2%（v/v）HAc 溶液作为参比。

2.4.6 . 13 C核磁共振
13 C NMR谱用核磁共振波谱仪(Bruker 300 MHz, USA)记录。将壳聚糖和Se-壳聚糖溶解在2％(v/v)C 2 D 4 O 2 /D 2 O溶液中，制备30mg/mL溶液。

2.5 . 植物栽培
挑选的绿豆种子大小、饱满度几乎相等。随后，将不同Se浓度（400 μg/L、800 μg/L、1200 μg/L、1600 μg）的种子置于琼脂（对照）和琼脂/硒-壳聚糖复合水凝胶（每组5颗种子）表面。 /L)，然后转移至25°C、80% 湿度和连续光照的生长室中。7天后，收获芽苗，测量植株重量和株高，研究水凝胶中硒浓度对芽苗生长的影响。

2.6 . 植物生物量的测量
收获芽后，测量生长指数，包括植物长度和植物重量，以探索硒壳聚糖形式的不同浓度的硒。将绿豆芽用去离子水清洗并在80°C的烘箱中干燥2天。然后，将干燥的样品研磨成粉末用于Se测定。

2.7 . 硒壳聚糖和豆芽中总硒的测定
为了测量豆芽和硒壳聚糖中的硒含量，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行微量元素分析。29称重约 0.03 g 样品并将其放入聚四氟乙烯坩埚中。然后，将8mL硝酸和2mLH 2 O 2添加到每个坩埚中并冷消解过夜。第二天，将样品在热板上加热直至溶液澄清透明。消化条件为130℃1h、150℃2h、180℃1h。将溶液蒸发至1~2 mL，转移至10 mL容量瓶中，用超纯水稀释至10 mL。30测定并计算出Se含量并绘制标准曲线，每个实验重复3次。

2.8 . 统计分析
每个实验一式三份进行。实验数据采用SPSS和Origin进行分析。P 值<0.05 被认为具有统计显着性。实验结果以平均值±标准差表示。31

3 . 结果与讨论
3.1 . 掺硒壳聚糖琼脂糖水凝胶的合成用于富硒豆芽
在此，首次开发了一种简单而新颖的制备掺杂硒壳聚糖的功能性琼脂糖水凝胶的路线。采用冰醋酸-亚硒酸盐(HAc-Na 2 SeO 3 )法合成可溶性壳聚糖。在Se-壳聚糖的制备过程中，将壳聚糖和亚硒酸盐溶解在2%（v/v）HAc溶液中。在HAc的催化下，壳聚糖的C 6 -OH和C 2 -NH 2因其高反应活性而与亚硒酸盐发生共价和非共价相互作用。随后，将琼脂糖粉末溶解在95℃去离子水中形成透明溶液，并将溶液冷却至60℃。然后，添加Se-壳聚糖溶液。将混合溶液冷却至室温下，掺杂Se-壳聚糖的琼脂糖水凝胶通过琼脂糖的氢键交联形成凝胶。32最后，利用硒可以扩散和渗透水凝胶的特性，我们获得了富硒芽苗，并实现了琼脂糖水凝胶的功能化，如图1所示。

3.2 . 壳聚糖的表征
3.2.1 . 傅立叶变换红外光谱
壳聚糖和Se-壳聚糖的FTIR光谱如图3A所示。壳聚糖的IR光谱在3300 cm -1和3500 cm -1之间显示出强宽带，这可能归因于O-H的伸缩振动和 N-H。2876 cm -1、1657 cm -1和1600 cm -1处的吸收峰分别归属于C-H伸缩振动、酰胺I振动和N-H弯曲振动。33与壳聚糖相比，Se-壳聚糖在 806 cm -1处出现了一个新的强吸收峰，归属于 Se双键O不对称拉伸，表明反应形成硒酯键。34 1025cm -1处的C 6 -OH峰消失，而1157cm -1处的C 3 -OH峰没有变化。可能是壳聚糖的C 6 -OH发生了硒酯化，而C 3 -OH不发生反应。此外，Se-壳聚糖的C-N和N-H峰向较低波数移动，这可能是由于壳聚糖中的氨基在酸性溶液中发生质子化以吸收亚硒酸根离子。35这些结果表明，Se-壳聚糖是通过 C 6的硒酯化成功合成的。-OH与氨基的静电引力，如图2所示。

3.2.2 . X射线衍射
壳聚糖和Se-壳聚糖的XRD图如图3B所示。壳聚糖在2θ = 20°处表现出尖锐的衍射峰，这表明其高度结晶的特性，因为壳聚糖的分子结构中存在大量氢键。壳聚糖，形成刚性结构。36但与壳聚糖相比，Se-壳聚糖的 XRD 图谱显示，2θ=20° 处的衍射峰强度明显下降，峰形变宽，表明壳聚糖原有的晶体结构被破坏。结果表明，通过硒化引入亚硒酸盐，发生在C 6 -OH和C 2 -NH 2中。壳聚糖的分子内和分子间氢键减弱，导致对称性和立体规整性受损，结晶度降低。37 , 38

3.2.3 . 热重分析
通过TGA和DTG曲线表征了壳聚糖和Se-壳聚糖的热稳定性，如图3C -D所示壳聚糖表现出两个不同的失重阶段，分别发生在 30-100 °C 和 250-380 °C。第一阶段的热分解归因于水的蒸发39和第二阶段的重量损失， DTG 曲线中的最大降解温度峰值 (Tmax) 为 302 °C，对应于脱水、解聚和分解。壳聚糖。40与壳聚糖相比，Se-壳聚糖的热分解可分为三个阶段，分别出现在30-100℃、130-200℃和200-350℃，并且在172℃时观察到新的T max ，这可归因于硒壳聚糖中硒酯的分解。显然， Se-壳聚糖的降解速度明显快于壳聚糖，这表明其热稳定性弱于壳聚糖。这应该归因于通过硒酯化和静电吸引将亚硒酸盐引入到壳聚糖主链上，破坏了壳聚糖的晶体结构和分子链之间的氢键，41导致Se-壳聚糖的稳定性较低。

3.2.4 . 紫外可见光谱
为了进一步证实亚硒酸盐与壳聚糖分子的接枝，我们对壳聚糖、硒壳聚糖和亚硒酸钠进行了紫外可见光谱分析。如图4所示，壳聚糖在226nm处具有非常弱的紫外吸收峰，因为壳聚糖没有发色团双键，仅残留乙酰胺中的CO有较弱的吸收。42 , 43硒化反应后，Se-壳聚糖在226 nm处的吸收峰明显增强。这是由于双键硒化反应引入的SeO的紫外吸收，表明SeO双键成功引入到壳聚糖的分子结构中。

3.2.5 . 13 C NMR谱
壳聚糖和Se-壳聚糖的13 C NMR谱如图5所示。探讨壳聚糖的硒化位点。根据文献，壳聚糖在97.5、76.2、74.5、70.1、59.9和55.8 ppm处的信号分别归因于C1、C3、C4、C5、C2和C6。44 Se-壳聚糖 57.3 ppm 处的新峰归属于 O-6 取代碳，表明亚硒酸与壳聚糖 C6 位羟基之间发生了酯化反应。然而，C-6峰仍保持在55.8ppm，表明内侧的伯羟基没有被硒化。45 , 46

3.3 . 掺杂 Se-壳聚糖的琼脂糖水凝胶的表征
图 6 A-B比较了琼脂（对照）和琼脂/Se-壳聚糖-Se (1600 μg/L) 的 FTIR 和 X 射线衍射图。3300和3400cm -1之间的吸收带归因于羟基的伸缩振动。47 770、890 和930 cm -1处的谱带归因于3,6-anydro-β-半乳糖骨架弯曲，位于1150 cm -1处的峰归因于-C- O -C- 伸缩振动。48 , 49与琼脂（对照）和琼脂/Se-chitosan-Se (1600 μg/L) 的光谱相比，在 Agar/Se-chitosan-Se (1600 μg/L) 的光谱中没有观察到新的峰，这可能这是由于Se-壳聚糖和琼脂糖的结构相似。少量的Se-壳聚糖不会影响琼脂糖水凝胶的结构，证实琼脂糖水凝胶保留了其原始结构。上述结果也可以通过X射线衍射光谱得到证实。由于琼脂糖大分子的单螺旋或双螺旋结构的短程有序，琼脂（对照）的 X 射线衍射图在 13.5° 和 20° 处显示两个宽峰，表明琼脂（对照）是纳米晶体。50此外，当Se-壳聚糖引入琼脂糖水凝胶中时，琼脂（1600 μg/L）的X射线衍射图几乎保持不变。水凝胶的多孔结构如图 6 C所示，其中显示了琼脂（对照）和琼脂/Se-壳聚糖-Se (1600 μg/L) 的 SEM 图像。显着观察到琼脂（对照）和琼脂/Se-壳聚糖-Se（1600 μg/L）均表现出穿孔、层状和均匀的多孔结构，这有利于植物的富硒栽培，因为硒可以扩散和沉积。易于储存在多孔水凝胶中。51

3.4 . 豆芽栽培
3.4.1 . 不同浓度硒对芽苗生长的影响
研究不同浓度的硒壳聚糖是否影响豆芽的发育。进行了一系列实验。选择绿豆作为模型，在以硒壳聚糖形式掺杂不同浓度硒（0-1600μg/L）的琼脂糖水凝胶中孵育7天，以研究硒壳聚糖对豆芽的生理效应。图7A是在掺杂不同浓度Se（0-1600μg/L）的琼脂糖水凝胶中培养的绿豆芽的照片。为了进一步获得准确的结果，测量了豆芽的株高和株重。如图7所示B~C，当水凝胶中Se浓度低于800μg/L时，随着Se浓度的增加，芽苗的生长并未受到太大影响。当Se浓度为1200μg/L和1600μg/L时，Se-壳聚糖处理对生长表现出负面影响，这可能是由于过量的Se进入豆芽，对豆芽的生长产生毒害作用。这些结果表明，在植物栽培过程中，合理控制硒含量非常重要。

3.4.2 . 不同浓度硒对芽菜硒含量的影响
通过 ICP-MS 测定 Se-壳聚糖的 Se 含量。结果表明，样品的硒含量从0mg/g增加到139mg/g，如图8A所示，高于其他含硒多糖。52 , 53 , 54 , 55 Se可以扩散和渗透水凝胶，植物可以通过根吸收硒，通过木质部运输到植物的茎和叶，并将不同形式的硒转化为硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys） ）和硒代蛋氨酸（MeSeCys）由植物和其他生物体产生。56、57、58、_ _ _ _59为了研究豆芽中硒的吸收情况，通过 ICP-MS 测量了在含 0–1600 μg/L Se 的不同琼脂/硒壳聚糖复合水凝胶中生长的豆芽的总硒含量，以估计不同硒浓度对硒的影响。豆芽中硒的积累。如图8B所示，随着水凝胶中Se浓度从0增加到1600μg/L，豆芽的Se含量也相应地从0.92mg/kg增加到6.79mg/kg。在我们之前的研究中，当用1600μg/L的亚硒酸盐、硒酵母和硒代角叉菜胶形式的硒处理时，豆芽中的平均硒含量分别为4.19毫克/公斤、1.35毫克/公斤和4.15毫克/公斤，这表明硒-壳聚糖对豆芽具有良好的富硒效果。14富硒水凝胶的使用技术可以达到获得富硒农产品的目的。

4 . 结论
综上所述，HAc-Na 2 SeO 3合成的Se-壳聚糖的Se含量最高为139 mg/g。FTIR、13 C NMR、XRD 和 UV-vis 证实亚硒酸盐通过壳聚糖 C 2 –NH 2和 C 6 –OH 的静电吸引成功引入到壳聚糖主链中，TGA 结果证实了硒化反应降低热稳定性壳聚糖。此外，我们设计并制备了Se含量为0-1600 μg/L的Se-壳聚糖掺杂琼脂糖水凝胶，并通过FTIR、XRD和SEM对其结构和形貌进行了表征，证明了复合材料交联结构的形成。水凝胶。掺杂硒壳聚糖的琼脂糖水凝胶用于富硒芽苗菜培养的结果表明，当水凝胶中硒含量为0~800 μg/L时，对芽苗菜的生长没有显着影响，而当水凝胶中硒含量为0~800 μg/L时，对芽苗菜的生长没有显着影响。 Se含量高于800μg/L时，芽苗生长受到抑制。从豆芽中硒含量来看，随着水凝胶中硒含量的增加，豆芽中硒含量也相应增加，当水凝胶中硒含量为1600μg/L时，豆芽中硒含量最高为6.79mg。 /公斤。所以，用于富硒植物栽培的硒-多糖复合水凝胶的功能化。