1. 简介

积雪草（ Centella asiatica，L.）是一种多年生小型草本植物，俗称虾科植物[ 1 ]。它几乎遍布世界各地，在稻田、河岸等阴暗、沼泽、潮湿的地区大量生长，形成一层厚厚的绿色地毯。叶有七脉，可食，形状为肾形、圆形或长圆椭圆形，薄，互生，黄绿色。这种植物通过其地下根和相互连接的绿色到红色的匍匐茎水平展开[ 2 ]。积雪草 的使用变得越来越流行，特别是用于治疗目的。积雪草 长期以来因其广泛的药用潜力而受到认可。它历史上曾用于治疗肝炎、麻疹、牙痛、梅毒、白带和腹泻等疾病[ 3 ]。与叶柄和根相比，叶子的植物化学物质浓度最高。其中烟酸、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2和维生素C也含量丰富[ 4 ]。一些重要的生物活性化学物质具有抗氧化、抗菌、抗溃疡、抗丝虫、抗病毒和许多其他作用，包括羟基积雪草酸、积雪草酸、α-萜品烯、α-可巴烯和β-石竹烯 [ 3]。目前，这些药草在孟加拉国北部进行商业化种植，而真菌病害是亚洲药材商业化种植的主要 威胁。

由于它们对各种传染性微生物的敏感性，导致质量和数量的损失，植物的产量因此减少。世界范围内引起亚洲积雪草 植物病害的几种真菌有Centelli Pseudocercospora centelli [ 5 ]、Cercospora centellae [ 6 ]、Fusarium equiseti [ 7 ] 等，对耕地植物造成严重损害。根部含有种类最多的内生真菌，这些真菌存在于积雪草的叶、匍匐茎和叶柄中。植物中最常见的内生真菌是Colletotrichum destructivum 、茄病 镰刀菌、角担子菌、链格孢属。和弯孢霉属。舒克拉等人。[ 8 ]报道称，影响药用植物的不同生物障碍经常导致产量和经济损失以及植物产品质量的变化。最危险的真菌病原体之一是链格孢属，它存在于世界各地的药用植物中。

使用分子标记（例如小亚基核糖体 DNA 以及来自核糖体 DNA 和其他蛋白质编码基因的序列数据）推断了几个链格孢属物种之间和种群内部的系统发育关系[ 9 ]。基因组 DNA 的 ITS 区域是这些方法中最有利于确定真菌之间的系统发育关系的方法。rDNA 的 ITS 区域是变化较多的区域之一。

真菌的生长、发育和产孢取决于培养基。此外，温度、湿度、pH 值等重要的环境因素对于真菌孢子的萌发、芽管的生长以及最终疾病的发展是必需的。因此，这些研究材料为正确鉴定孟加拉国积雪 草病原真菌提供了重要信息。因此，本研究工作旨在通过基于ITS区域的形态和分子特征来鉴定和评价积雪草叶枯病中的链格孢(Alternaria alternata) 。

2。材料和方法

2.1. 样品采集

积雪草叶枯病在孟加拉国达卡萨瓦尔的贾汉吉尔纳加尔大学校园和孟加拉国马尼贡杰区的许多地方都发现了。为了分离和鉴定致病微生物，将收集的患病样本单独包装在无菌塑料袋中。为了进一步研究，这些样本随后被保存在实验室。

2.2. 真菌的分离和形态特征

采用组织种植技术从C. asiatica叶枯病症状中提取真菌。亚洲茶 的感染部分被切成 0.5 厘米长的碎片，旨在包含真菌感染和未感染的组织。之后，将物品用NaOCl（5%）溶液消毒3分钟，然后用蒸馏水反复清洗。将四个样品放入 PDA 培养基中，在 25°C 温度下培养 10 天，随后黑暗和光照 12/12 小时。将生长的菌丝体转移到新鲜的 PDA 平板和 PDA 斜面上，以产生纯培养物。使用传统方法根据菌落大小、形状、菌丝体和分生孢子梗对分离真菌的纯培养物进行显微镜鉴定[ 10 ]。

2.3. 培养基、温度和 pH 对真菌生长的影响

八种不同的培养基，包括蔗糖葡萄糖琼脂（SGA）、酵母提取物琼脂（YEA）、蜂蜜蛋白胨琼脂（HPA）、麦芽糖琼脂（MA）、胡萝卜琼脂（CA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、蜂蜜琼脂（HA） ）和马铃薯蔗糖琼脂（PSA），根据 Alam等人的方法制备，用于测量分离真菌的菌丝体生长。[ 11]。为了确定分离真菌菌丝体发育的最佳温度，评估了不同水平的温度条件（15°C、20°C、25°C、30°C 和 35°C）。为了研究 pH 的影响，借助数字 pH 计将 PDA 培养基习惯于 pH 5、6、7、8 和 9，并添加 1 N NaOH 或乳酸调节 pH，然后高压灭菌。高压灭菌后，将培养基倒入培养皿中，并将含有来自培养 7 天的 PDA 培养基的测试真菌的 2 毫米直径琼脂块放置在每个琼脂板的中心，然后在 30°C 下孵育 7 天。根据阿拉姆等人的说法。[ 11 ]，从三个方向评估每个培养皿上菌丝体的径向发育。

2.4. 分子表征

分子表征是在显微镜检查后通过孟加拉国达卡 Invent Technology 提供的商业服务进行的。Maxwell Cell Kit（AS1030，Promega，美国）用于从真菌样品中提取基因组 DNA。PCR 实验使用引物 ITS4 (5'-TCCTCCGlCTTATTGATATGC-3') 和 ITS5 (5'-GGAAGTAAA AGTCG TAACAAGG-3') [ 12]。在带有 LA Taq（TAKARA BIO INC，日本）的 25 µl 反应混合物中，使用 20 ng 基因组 DNA 作为模板进行 PCR 反应。Taq 聚合酶在 94°C 下激活 1 分钟，然后进行 35 个循环，即 94°C 30 秒、55°C 30 秒和 72°C 5 分钟，最后在 72°C 下 10 分钟最后的扩展。1 kb DNA 梯子用作大小标记，扩增的 PCR 产物在含 1 TAE 缓冲液的 1.5% 琼脂糖凝胶上以 100 V 电泳 1 小时，然后在 EtBr 溶液（0.5% g/毫升）。使用紫外透照仪观察并拍摄染色凝胶。使用 Maxwell® 16 DNA 纯化试剂盒（Promega，美国）纯化扩增产物。马来西亚First BASE Laboratories SdnBhd 对纯化的PCR 产物进行了双向测序分析。

BioEdit 和 MEGA6 用于验证 DNA 序列。NCBI 收到的测序数据的登录号为 JUF0039。ITS 序列用于 BLAST 搜索来识别最匹配的分类单元。MEGA6 用于执行多重序列比对。Clustal W 用于将数据从 fasta 转换为 MEGA 格式。赤池信息准则（AIC）用于识别进化模型。Tamura-3 参数是用于研究的模型。在执行最大似然 (ML)、邻接连接 (NJ) 和最大简约 (MP) 分析后，使用 1000 次引导重复和最大树设置 1000 来评估分支的稳健性。停止条件用于推断复制次数。根据田村等人的说法。[ 13]，引导值优于 60% 是可以接受的。

2.5. 统计分析

使用MS Excel、SPSS 16.0、MEGA 11.0程序和BLAST工具等标准统计分析工具来分析研究工作中产生的数据。使用 SPSS-16 中邓肯事后检验的单向方差分析对数据进行分析。

3 结果与讨论

3.1. 积雪草 黑斑病​

黑斑病是积雪草 最主要的真菌病害之一。这种疾病的症状之一是出现不规则的、通常是圆形的、棕色至深棕色的叶斑，斑点内有同心线。当圆形斑点结合形成大面积时，经常会引起叶枯病（图 1）。很多时候，娇嫩的树枝和豆荚也会有小黑斑。从形态来看，链格孢属在寄主叶的初始攻击部位周围形成一系列同心环。症状首先出现为不规则形状的斑块，颜色从浅棕色到深棕色再到黑色，整个叶片周围被坏死的空洞包围。顶部和中部的叶子逐渐受病害。

3.2. 链格孢的形态学

孢子的基部最宽，逐渐变窄，形成细长的喙。多形分生孢子的产生，无论是单个的还是短链或长链的，具有横向、纵向以及倾斜的隔膜和较长或较短的喙，是该物种的显着特征。这些多食性真菌的孢子经常在土壤和大气中发现。大多数链格孢属物种都有分生孢子梗，可产生长度在 160 至 200 µm 之间的无性分生孢子 [ 14]。发现菌丝体具有分枝、隔膜、亚透明和光滑至疣状菌丝，其位于表面或水下水平。分生孢子梗通常是单生的、棕色的、大型线状的、简单的或分枝的或具有一到多个膝状的，或者在单个菌丝中具有多个椭圆形或卵形的分生孢子（图2）。

3.3. 链格孢 的生长特性

图3和图4显示了几种培养基（包括SGA、CA、PSA、YEA、PDA、HA、HPA和MA）对链格孢菌丝体发育的影响 。结果显示，PDA培养基中的链格孢菌菌丝生长量最大（69mm），其次是YEA培养基，而HPA培养基中的菌丝生长量最低（27mm）。

几位真菌学家报告说，PDA 因其简单的成分和支持真菌菌丝生长的能力而成为理想且最常用的培养基之一 [15, 16]。目前的实验结果支持了早期研究人员的结果，他们对链格孢属的最佳条件进行了生理研究。生长和孢子形成。链格孢 在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)、V8 果汁琼脂 (V8 Agar) 和真菌琼脂 (MA) 培养基上生长，结果表明 PDA 和 V8 琼脂是孢子形成的两种最佳培养基 [ 17 ]。根据普拉迪普等人的说法。[ 18]，PDA (74.96 ± 0.35 mm) 的径向菌丝生长最高，其次是麦芽提取物琼脂 (74.03 ± 0.25 mm) 和燕麦粉琼脂 (74.03 ± 0.15 mm)。在八种培养基上测试了红斑链 格孢的生长。结果表明，马铃薯葡萄糖琼脂 (90.00 mm) 提供了最大的生长，其次是马铃薯麦芽琼脂 (84.16 mm)，具有良好的孢子形成 [ 19 ]。根据这项研究，PDA 是分离真菌菌丝生长的最佳培养基。

根据温度测试分离的病原体的菌丝生长，并以图形方式呈现结果，其中在接种 7 天后测量分离的病原体的菌丝生长。实验板在15℃、20℃、25℃、30℃和35℃五个不同温度下孵育，结果如图5所示。目前的研究着眼于温度如何影响体外环境中 PDA 培养基上链格孢菌(Alternaria alternata)的径向菌丝发育。根据研究结果，A. alternata在 30°C 时生长速度最快，然后是 25°C。镰刀菌菌丝体生长和产孢率最高 我们的实验在 30°C 下记录了茄病，在 30°C 时发现菌丝生长和孢子形成急剧下降，这与 Ahmmed等人的发现相似。

虽然 pH 值是了解腐烂真菌生态的关键因素，但本研究的实验板在 5、6、7 和 8 四种不同的 pH 水平下培养。Alternaria alternata在pH 6 时，而 pH 8 时菌丝生长最低（12.2 毫米）（图 6）。为了确定对红斑 病菌生长的影响，研究了九种 pH 值。结果表明，在pH 6.5时，优良的孢子形成导致最大的平均菌丝生长（85.83毫米），其次是在pH 6（82.00毫米）和pH 7（70.33毫米）时分别优良和良好的孢子形成。根据 Singh [ 21 ]，A. 甘蓝发育和产孢的最适温度为22℃，最适pH为5.5。然而，在体外环境下， 评估了不同pH值对链 格孢生长的影响。实验结果表明，6.00至6.50的pH范围最适合链格孢菌的 生长[ 22 ]。

3.4. 链格孢 的分子鉴定

真菌 rDNA 极其多样化的 ITS 区域对于使用 PCR 来识别不同种类的真菌至关重要。使用 ITS4 和 ITS5 引物，在测序之前扩增 558 bp 长的 ITS 区域以进行分子鉴定。然而，同属的其他物种的ITS区域较短（图7）。通过引物 ITS4 和 ITS5 产生的 PCR 产物的凝胶电泳对链格孢 的内部转录间隔区进行定量。因此，这一特征可能有助于区分链格孢 (Alternaria alternata)来自同一属的其他物种。基因组 DNA 的 ITS 区域最近被证明对于通过分子系统发育分析识别较低分类水平的真菌非常有帮助。根据阿拉姆等人的说法。[ 11 ]，rDNA 的 ITS 区域在物种之间甚至菌株之间存在差异。

使用ITS4和ITS5引物，对ITS区域进行扩增和测序（图8）。根据 ITS 部分的核苷酸序列，从 NCBI 数据库中选择了 39 个真菌物种进行系统发育分析。使用最大简约法在系统发育树中发现了六个不同的簇。对先前发现的真菌 KX926578 和 ITS 区域的 rDNA 序列 (MN 886593.1) 进行了同源性百分比评估。ITS区域序列的相互同源性为99%。结果表明，Alternaria alternata的所有个体均属于主要集群。在 PCR 中使用常见的单引物对，可以快速、轻松地扩增 ITS 区域。观察到相同 ITS 序列和遗传距离之间的高度相似性。根据生态分布、碱基位置的取代和插入或缺失多态性，这些菌株可以很容易地彼此区分[11, 23]。大小变化是由核苷酸数量的变化引起的。根据阿拉姆等人的说法。[ 24] ITS 序列在一个属的物种之间波动，但在遗传上是稳定的或在物种内表现出很小的变化。所检查的菌株之间良好的遗传相容性和群体内有效的基因流动可能是群体内遗传多样性的原因。结果表明积雪草链格孢叶枯病是由链格孢( Alternaria alternata)引起的，分子证据结果也支持和证实了本研究的发现结果。